丝裂原活化蛋白激酶4、生存素基因在喉鳞状细胞癌组织中的表达及其意义

单凤金,张 义,许尧生

(衡水市人民医院耳鼻咽喉头颈外科,河北 衡水 053000)

喉癌是耳鼻喉科常见的恶性肿瘤之一,多发于50～70岁男性,以鳞状细胞癌最为常见,喉癌好发年龄为40～60岁,男性多于女性,喉癌病因迄今尚未完全阐明,除外源性因素(吸烟、饮酒、病毒感染和空气污染等)外,也与内源性因素(如:促癌基因激活、抑癌基因失活和凋亡相关基因异常表达等)关系密切[1-2]。丝裂原活化蛋白激酶4(Mitogen-activated protein kinase kinase 4,MKK4)是MAPK的激酶,也是癌基因Ras信号传导通路的中心环节,经亚细胞定位研究发现,MKK4蛋白主要定位于细胞质,细胞核中也有MKK4蛋白表达[3-4]。生存素(Survivin)是由细胞内质网络激活后所生成的一种抗凋亡蛋白,参与调节细胞有丝分裂过程,其过度表达可加速细胞周期的S期转换,启动有丝分裂及细胞周期[5]。研究发现,膀胱癌、胃癌、食管鳞状细胞癌等肿瘤中Survivin出现过度表达,MKK4与多种恶性肿瘤关系密切,包括:鼻咽癌等[6-7]。基于此,本研究观察MKK4、Survivin基因在喉鳞状细胞癌组织中的表达,探讨其在喉癌发生、发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择本院2015年1月至2017年5月收治的82例喉癌患者,病例纳入标准:首次手术;术后经病理诊断为喉鳞状细胞癌;术前未接受放化疗;临床病理资料完整;本试验内容患者与家属均知情,并已签署知情同意书。排除标准:伴有心、肝、肾、肺等疾病;凝血功能障碍;合并其他自身免疫疾病、精神疾病及恶性肿瘤。82例患者中男62例,女20例,年龄35～82岁,平均(62.94±8.32)岁;TNM分期:Ⅰ期23例,Ⅱ期30例,Ⅲ期21例,Ⅳ期8例;分化程度:高分化25例,中分化36例,低分化21例。收集82例喉癌患者肿瘤组织、癌旁组织(距癌组织>0.5 cm)的石蜡标本待测。

1.2 主要试剂和仪器 总RNA提取、Trizol试剂、BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海联迈生物工程有限公司,货号:LM3201-1、LM-21087R、LM0012S);反转录试剂盒(雅吉生物,货号:D1801XL);DAB显色试剂盒(上海源叶生物科技有限公司,货号:R21317);实时荧光定量PCR仪、光学显微镜(日本 Olympus公司);Model 680 酶标仪、电泳仪(美国 Bio-Rad公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 RT-PCR检测组织中MKK4、Survivin mRNA表达:取肿瘤组织、癌旁组织,研磨破碎,总RNA以Trizol法提取,并取2 μg RNA行逆转录后并扩增,引物序列:MKK4上游5’-CGGGTTCTTCTCTGGTCCTTG-3’,下游5’-CTGACAGTGGTGCAGTTCCA-3’;Survivin上游5’-TCGGCTCTTCACTCCCAACA-3’,下游5’-TCAACTTCAGTGCTTTGCGTT-3’;内参GAPDH上游5’-GACCACTTTGTCAAGCTCTATTTCC-3’,下游5’-GTGAGGGTCTCTCTTCCTCTTGT-3’,扩增于常规条件下展开,经40个循环后,利用凝胶成像仪获取图片,2-ΔΔCt对样本基因进行表达差异相对定量分析。

1.3.2 免疫组化检测组织中MKK4、Survivin蛋白表达:取肿瘤组织和癌旁组织,经脱蜡、脱苯、水化和抗原修复后,用3% H2O2去除内源性过氧化物酶,清洗并封闭10 min,分次加入MKK4单克隆抗体、Survivin抗体,4 ℃过夜,以PBS洗涤2 min,共3次,加入二抗,37 ℃ 20 min,以PBS洗涤2 min,共3次,加试剂SABC,37 ℃ 20 min,以PBS洗涤5 min,共4次,加入DAB显色剂,苏木精-复染、脱水干燥后封片,以PBS为阴性对照,于显微镜下观察。

1.4 结果判定 MKK4、Survivin阳性表现为淡黄色至棕褐色颗粒,光镜下随机以5个高倍视野观察阳性细胞数和细胞总数。按染色强度分0～3分,无色、淡黄色、棕黄色和棕褐色。按阳性染色细胞百分率分为1～3分,1分为11%～50%,2分为51%～75%,3分为>75%,>3分为阳性(+),≤3为阴性(-)。

1.5 随 访 随访5年,以复诊、电话等方式记录患者生存情况。

2 结 果

2.1 喉癌组织和癌旁组织MKK4、Survivin mRNA表达比较 喉癌组织MKK4 mRNA表达较癌旁组织降低,Survivin mRNA表达较癌旁组织增加(均P<0.05),见表1。

表1 喉癌组织和癌旁组织MKK4、Survivin mRNA表达比较

2.2 喉癌组织和癌旁组织MKK4、Survivin蛋白表达比较 MKK4、Survivin蛋白主要定位于细胞质,少部分位于细胞核中呈棕黄色;癌旁组织和喉癌组织MKK4 蛋白阳性表达率分别为71.95%(59/82)和40.24%(33/82),Survivin 蛋白阳性表达率分别为23.17%(19/82)和71.95%(59/82)(χ2= 16.737,χ2=39.117,均P<0.01)。见图1。

图1 喉癌组织和癌旁组织MKK4、Survivin蛋白表达(免疫组化染色,×400)

2.3 MKK4、Survivin蛋白阳性表达与临床病理参数的关系 不同性别、年龄患者喉癌组织MKK4、Survivin蛋白阳性表达比较,无统计学差异(均P>0.05);在不同TNM分期、肿瘤分化程度和有无淋巴结转移患者中比较,差异有统计学差异(均P<0.05)。见表2。

表2 MKK4、Survivin蛋白阳性表达与临床病理参数的关系[例(%)]

2.4 MKK4、Survivin表达的相关性 Spearman相关性分析显示,喉癌组织中MKK4与Survivin表达为负相关(r=-0.403,P<0.05)。

2.5 随访5年生存率 随访结果,MKK4阳性患者5年生存率81.82%(27/33)高于阴性患者65.31%(32/49),Survivin阳性患者5年生存率62.71%(37/59)较阴性患者82.61%(19/23)下降(χ2=7.419,χ2=11.060,均P<0.05),见图2。

图2 MKK4、Survivin(+)和(-)表达患者的生存曲线

2.6 喉癌患者预后因素Cox回归模型分析 Cox回归模型分析显示,影响喉癌患者预后的因素为TNM分期和MKK4、Survivin(均P<0.05),见表3。

3 讨 论

喉癌是耳鼻喉部最为常见的恶性肿瘤,其发病率占全身恶性肿瘤的5.7%～7.6%,近几年,发病率及病死率均有所增长,可能与喉癌早期无明显症状,诊断比率较低有关,延误了患者的最佳治疗时机[8-9]。且当晚期患者行全喉切除术后,发声功能会受到永久影响,临床中治疗中要对喉腔发声、呼吸等尽可能保留,以提高患者生活质量,为此诸多研究人员逐渐开展,如:生物学疗法、基因疗法等新式喉癌疗法[10-11]。Survivin基因位于染色体17q25,其分子含有杆状病毒凋亡抑制蛋白(IAP)重复序列(BIR)和α螺旋分子结构,前者含有促癌细胞凋亡的氨基酸,可作用于Caspase 路径,对其正常功能造成干扰,而α螺旋结构能在有丝分裂早期同组成纺锤体的微管结合,这能使癌细胞进入有丝分裂期,加快肿瘤的恶性程度和侵袭性[12-16]。MKK4基因定位于人染色17p11.2,为MAPK信号传导通路的重要组成部分,能磷酸化并激活其通路分支,在将细胞外信号传导至细胞及核内后,引起细胞生物学反应,包括:增殖、分化及凋亡等[17-18]。

本研究中,喉癌组织中Survivin mRNA表达高于癌旁组织,喉癌组织Survivin 蛋白阳性表达率为71.95%高于癌旁组织,喉癌组织中MKK4 mRNA表达低于癌旁组织,喉癌组织MKK4 蛋白阳性表达率为40.24%,癌旁组织MKK4 蛋白阳性表达率高达71.95%,并且和肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关。并推测MKK4蛋白表达下调可能是喉癌发生的启动因素之一,Survivin高表达是肿瘤恶性表型的标志。Survivin表达水平增加后,对细胞凋亡产生抑制,使有丝分裂启动,组织出现增生,组织的分化、肿瘤生长的速度和转移能力增强[19-24]。而MKK4在人类多种类型的肿瘤中出现过缺失或突变,突变率约为5%,当外界环境或细胞内信号对细胞产生刺激后,这类基因将引起JNK或p38通路的活化,造成肿瘤细胞内微环境的改变,使MKK4蛋白表达异常[25-28]。杨光等[29]也证实,癌旁组织Survivin阳性表达率低于喉癌组织,Ⅲ-Ⅳ期的患者表达率较Ⅰ-Ⅱ期高,淋巴结转移者较无淋巴结转移者升高。杨花荣等[30]通过免疫组化技术检测发现,Ⅲ-Ⅳ期、淋巴结转移患者MKK4蛋白阳性表达率分别为57.14%和61.22%,较Ⅰ-Ⅱ期、无淋巴结转移患者明显下降。张慧等[31]证实了,MKK4基因在结直肠癌组织中的表达显著下降。以上研究证明了MKK4与鼻咽癌的负相关性。此外,随访5年,MKK4阳性患者5年生存率81.82%(27/33)高于阴性患者65.31%(32/49),Survivin阳性患者5年生存率62.71%(37/59)低于阴性患者82.61%(19/23)。Cox回归模型分析,影响喉癌患者预后的因素为TNM分期和MKK4、Survivin。这也说明Survivin高表达与患者预后不良密切相关,MKK4低表达与患者预后不良密切相关。

综上所述,喉癌组织中MKK4表达下调,Survivin表达上调,两者可能是潜在的预后标记物以及治疗靶点。深入研究 Survivin和MKK4在喉癌中的作用机制,将对喉癌的治疗提供新思路。