红景天苷对Lewis肺癌小鼠恶性胸腔积液的抑制作用及其对免疫功能的影响

王松海,凡 瑾,陈 捷

(1.陕西省中医医院肿瘤科,陕西 西安 710003;2.陕西中医药大学,陕西 咸阳 712046)

目前肺癌在全球范围内成为所有癌类疾病中最为常见的类型,我国肺癌发病率及病死率均居首位[1]。恶性胸腔积液(Malignant pleural effusion,MPE)是原发于胸膜或其他部位的肿瘤细胞转移至胸膜所引起的异常胸腔积液,为中晚期非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)临床常见的并发症之一。MPE常生长迅速,反复胸腔置管引流可引起蛋白大量丢失,中等量积液即可引起显著的胸闷、气短等症状,严重影响生存时间[2],临床治疗多以缓解呼吸困难症状为主。

红景天属于景天科红景天属植物,其主要的活性成分为红景天苷(Salidroside,SAL),具有抗疲劳、抗氧化、抗肿瘤等作用[3-4]。本课题组前期的临床工作发现,运用大株红景天注射液联合胸腔灌注治疗肺癌MPE患者临床效果良好。本研究采用红景天苷为研究对象,建立Lewis肺癌小鼠模型,观察SAL联合顺铂对 Lewis肺癌小鼠MPE的抑制作用及其可能机制,为 SAL 治疗 MPE 的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物与细胞:实验动物选择C57BL/6小鼠共40只,均购自第四军医大学实验动物中心,雌雄各20只,鼠龄8周,体重20 g,饲养在SPF级环境下。小鼠Lewis肺癌瘤株GFP-LLC细胞,上海研生实业有限公司提供。

1.1.2 主要试剂:SAL (HPLC 法检测纯度> 98%,CAS:82373-94-2)购自四川维克奇生物科技有限公司; DMEM培养基、胎牛血清购自Gibco公司;人肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)购自武汉赛培生物,货号:SP10205;低氧诱导因子(Hypoxia inducible factor 1alpha,HIF-1α)购自苏州卡尔文生物科技有限公司,批号:E20181118A;血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)美国R&D 公司 ELISA 试剂盒,批号:17795715182;注射用顺铂(冻干型)购自齐鲁制药有限公司,批号:1K0574B02。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养:使用小牛血清的高糖DMEM完全培养基(100 IU/ml青霉素、100 IU/ml链霉素),在CO25%、37 ℃的孵箱里进行GFP-LLC细胞系培养。每3天传代一次,取对数生长期、长势好细胞完成实验,细胞计数板计数,最终制备成浓度为5.0×106个/ml的细胞悬液 。

1.2.2 小鼠建模方法:实验动物选择C57BL/6小鼠,将GFP-LLC细胞制成浓度为2.5×106个/ml(PBS缓冲液调节浓度)的细胞悬液,碘伏消毒小鼠胸前区皮肤,使用1 ml注射器抽吸制备好的LLC细胞悬液,使其充分混匀后,自小鼠胸部右侧靠近腋中线,约平第6肋间隙处注射入胸腔,每只小鼠注射0.2 ml。连续注射14 d后CT检查表明建模成功。

1.2.3 实验分组:选取40只老鼠,每组8只,进行实验。①正常组:正常未加任何实验C57BL/6小鼠,胸腔注射0.9% NaCl 0.4 ml,1次/d;②模型组:在造模成功的基础上,胸腔注射0.9% NaCl 0.4 ml,1次/d;③SAL组:在造模成功的基础上,皮下注射SAL(SAL 50 mg/kg),1 次/d;④化疗组(DDP组):在造模成功的基础上,胸腔注射顺铂5 mg/kg,隔 3 d 1 次;⑤SAL+DDP组: 在造模成功的基础上,给予红景天苷1 次/d和顺铂隔1 次/3 d (SAL 50 mg/kg+顺铂5 mg/kg)。 连续给药2周。第 15 天,颈椎脱臼法处死后立即解剖取材备用。

1.3 观察指标

1.3.1 MPE标本采集及体积测量:给药第15天每组选取8只小鼠,乙醚麻醉小鼠后。将小鼠仰卧位固定于解剖板上,消毒胸部皮肤,依序剥离胸部皮肤、肌肉、壁层胸膜等结构,观察胸水性状,用 1 ml 注射器收集胸水并测量体积。将收集到的胸水置于1.5 ml EP管内,加入3.8%枸橼酸钠抗凝,以枸橼酸钠∶胸水体积比1∶9混合,随即放于冰中快速冷冻。并以2500 r/min于4 ℃离心机中离心10 min,取上清液,-70 ℃保存。收集胸膜、肺、纵隔肿瘤组织,以4%甲醛固定,-80 ℃保存标本备用。

1.3.2 生存周期计算:实验结束后统计21 d内,各组小鼠存活情况。

1.3.3 检测小鼠血清中HIF-1α、TNF-α、VEGF的表达水平:使用酶联免疫吸附法(ELISA)。

1.3.4 细胞免疫指标:在治疗的前1 d及完成2个周期治疗后早晨采血,流式细胞仪定量检测T细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+及自然杀伤细胞(Natural killer cell,NK)。

2 结 果

2.1 各组小鼠生存时间比较 小鼠平均生存时间以SAL+DDP组最长(16.88±1.46)d,模型组最短 (10.13±1.73)d。DDP组、SAL+DDP组与模型组比较,差异有统计学意义 (均P<0.05),见表1。

表1 各组小鼠生存时间比较

2.2 各组MPE小鼠胸腔积液比较 经治疗,SAL组、DDP组和联合组小鼠MPE体积减小(均P<0.05); 与模型组比较,SAL组、DDP组、SAL+DDP组小鼠MPE体积减少显著,比较差异有统计学意义(均P<0.01)。见表2。

表2 各组MPE小鼠胸腔积液比较(μl)

2.3 各组MPE小鼠血清中TNF-α、HIF-1α、VEGF水平比较 与正常组相比,模型组外周血TNF-α水平降低,而HIF-1α、VEGF值升高(均P<0.05);与模型组比较,SAL组、DDP组和SAL+DDP组外周血中TNF-α水平均升高,HIF-1α、VEGF水平降低,比较差异有统计学意义(均P<0.05)。见表3。

表3 各组MPE小鼠血清中TNF-α、HIF-1α、VEGF水平比较

2.4 各组小鼠治疗前后免疫细胞比较 造模成功后,与正常组比较,模型组、SAL组、DDP组和SAL+DDP组各组小鼠免疫细胞均显著减少(均P<0.05),各组之间免疫细胞水平比较无明显统计学差异(均P>0.05)。分组治疗后与模型组相比较,SAL组、DDP组和SAL+DDP组血清CD3+均显著升高(均P<0.05);SAL组、SAL+DDP组CD4+均显著升高(均P<0.05),DDP组CD4+升高但差异无统计学意义(P>0.05);SAL组、SAL+DDP组CD8+、CD4+/CD8+、NK数值均显著升高 (均P<0.05),而DDP组降低(P>0.05)。见表4。

表4 各组小鼠治疗前后免疫细胞比较

3 讨 论

恶性胸腔积液(MPE)是原发性胸膜肿瘤或肿瘤转移至胸膜最常见的临床症状,仅有3～12个月的中位生存期,肺癌是导致MPE最主要的原因,无 MPE肺癌患者中位生存期明显优于并发MPE者,后者仅为 3～4个月[5-6]。目前MPE治疗方法包括胸膜固定术、导管引流术、胸腔镜及胸腔灌注术等,可有效缓解呼吸困难,但多数患者难以彻底治愈或长期控制,反复操作感染风险明显增加[7-9]。目前MPE发病机制较多,包括淋巴回流障碍,血管活性因子过度表达引起胸膜腔血管新生、血管通透性增高,胸膜腔局部的肿瘤细胞与免疫细胞相互作用进而形成促恶性胸腔积液生成的免疫微环境等学说[10-11]。

目前研究表明中医药在恶性肿瘤治疗,尤其是肿瘤晚期恶液质、恶性积液、癌性疲乏等方面具有创伤小、并发症少、副作用轻、可长期服用的治疗特点。多个研究发现红景天苷不仅具有抗疲劳、抗氧化、抗衰老、抗炎、抗纤维化等作用,还可通过抑制细胞增殖、迁移、侵袭等发挥抗肿瘤作用[12-14]。本课题组前期通过临床观察发现静脉滴注大株红景天注射液联合顺铂胸腔灌注可以抑制MPE的产生[15],但是对于进一步红景天苷如何抑制胸水产生,是否抑制肿瘤血管产生,是否与局部胸腔免疫活性激活有关,与铂类化疗药物联合运用是协同作用还是拮抗作用,尚不明确。

因此本次研究采用红景天苷联合顺铂观察MPE小鼠模型中相关分子表达情况,结果显示与模型组比较,SAL组、DDP组和SAL+DDP组的MPE体积明显下降,生存时间增加,SAL组和DDP组与SAL+DDP组小鼠MPE的体积和生存时间相比差异明显,表明SAL和DDP联用对肿瘤生长和MPE的抑制发挥协同作用。化疗药物可直接杀灭肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞增殖,但毒副作用较大,中晚期患者常耐受不佳,结合中药以扶正祛邪、增效减毒,或可部分改善MPE患者的耐受性,提高临床疗效[16]。

血管内皮生长因子(VEGF)是促进血管生成、调节血管通透性的关键因子。研究发现,与癌旁组织标本相比,肺癌组织中VEGF阳性表达率及肿瘤血管密度(MVD)明显更高,且二者呈正相关[17]。据报道,胸膜VEGF水平高的MPE患者生存期明显低于VEGF水平正常者[18]。随着肿瘤体积的增长,氧气的需求逐渐增大,而肿瘤组织内的病理性新生血管不能满足肿瘤组织生长所需氧量,形成瘤体内的相对低氧环境,进而刺激肿瘤细胞分泌HIF-1α,该因子是VEGF通路的上游因子,可使肿瘤细胞分泌的VEGF-A增多,与内皮细胞表面的VEGFR-2结合后发挥促血管生成作用[19]。相关研究也表明抑制VEGF可导致母血管塌陷为肾小球微血管增生,逐渐变化为正常的微血管[20]。VEGF调节血管通透性的作用是组胺的50000倍,能够有效提升微小静脉的血管通透性,导致血浆蛋白和纤维蛋白外渗至细胞外间隙,进而诱发MPE[21]。通过ELISA检测各组HIF-1α、VEGF水平,发现SAL组、DDP组和SAL+DDP组小鼠HIF-1α、VEGF水平明显下降,表明单纯红景天组或联合治疗均可抑制HIF-1α、VEGF的产生,在抑制肿瘤血管新生、降低血管通透性中二者具有协同作用,从而达到抑制MPE生成的作用。

近年来关于MPE局部免疫微环境的研究越来越多,活性下降的宿主免疫细胞与肿瘤细胞相互作用,使胸膜腔局部免疫微环境有利于MPE的生成[22]。活化的单核巨噬细胞、NK细胞等多种细胞可共同形成TNF-α,这是一种可参与机体炎症反应、免疫调控、细胞凋亡等多种信号传导通路的细胞调节因子。TNF-α在不同的细胞环境下具有促癌与抗癌的双重作用,主要通过破坏血管内皮的完整性、减少肿瘤新生血管形成、诱导细胞凋亡等方式抗肿瘤[23-25]。ELISA检测各组TNF-α水平,发现SAL组、顺铂组和SAL+顺铂组小鼠TNF-α水平较模型组明显上升,同时我们还发现治疗后SAL组和SAL+DDP组小鼠血清CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值、NK细胞高于模型组。可见,红景天苷对免疫细胞的免疫功能具有较强的促进作用。

综上所述,对晚期反复发作MPE患者,中药红景天具有减少MPE生成、提高免疫功能的作用,且与化疗药物联合应用时作用明显。由于本研究的局限性,需深入研究及推广应用以进一步验证红景天对MPE的功效。