铁死亡在脑缺血再灌注中的作用研究进展

施嘉华,陈真珍,黄龙坚,王凯华

(1.广西中医药大学,广西 南宁 530200;2.右江民族医学院,广西 南宁533000;3.广西中医药大学附属国际壮医医院,广西 南宁 530201)

铁死亡(Ferroptosis)是一种依赖于铁的程序性细胞死亡方式,2012年正式提出[1]。不同于凋亡、焦亡或者自噬,铁死亡是一种以细胞内铁过载为起因,脂质过氧化物活性氧(Reactive oxygen species,ROS)过度积累而产生的细胞死亡。缺血性脑卒中是全球第二大死亡原因和第三大残疾原因,在中医又被称为“中风”。就现在广为使用的治疗方式而言,患者仅能在发病的3～6 h内接受血管内介入治疗才能获得较好预后,而对大部分患者而言想及时接受治疗是非常困难的。大量研究表明铁死亡参与人体多种疾病的发生发展[2],如肾病、糖尿病、心血管病等,在一些疾病中(如脑缺血性卒中)抑制细胞铁死亡可以挽救机体损伤,而在肿瘤中靶向诱导铁死亡则可以减小肿瘤体积,达到控制疾病进展目的。本文通过综述铁死亡的各个环节以及各种调控铁死亡的细胞通路和其在脑缺血再灌注中产生的影响来加深对这一细胞死亡方式的理解,并为后续通过研究靶向脑缺血再灌注中细胞铁死亡来保护脑神经提供新的思路。

1 铁死亡概述

铁死亡是一种不同于自噬、焦亡和凋亡的程序性细胞死亡方式(Regulated cell death,RCD),主要特征是细胞体积缩小、游离铁增加、线粒体膜密度增加和ROS的铁依赖性积累[3]。过去有大量研究表明,铁死亡的本质是由氧化应激诱导的铁依赖性脂质过氧化物大量积累,主要有两个环节可作为思考治疗靶点的基础:①铁的运输和代谢,②脂质过氧化物和自由基的清除。往往一种抑制细胞铁死亡的药物是靠多个环节联合发挥疗效的。红花黄(CY)是一种已知能减轻心脏缺血及再灌注损伤的药物[4]。GUO等[5]的研究表明,在MCAO模型大鼠中使用CY治疗对CIRI后神经功能缺损有显著作用,不但减轻了损伤部位的炎症反应,还通过逆转谷胱甘肽过氧化物酶 4(Glutathione peroxidase 4,GPX4)、铁蛋白重链1(Ferritin heavy chain 1,FTH1)的表达水平从而减少了Fe2+和活性氧的积累,也逆转了血清中谷胱甘肽(Glutathione,GSH)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)以及丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的水平。

1.1 铁的代谢 铁是人体所必需的微量元素之一。最广为大众所知的用途就是参与红细胞生成,比如铁缺乏可能造成贫血等。食物中的铁以Fe3+形式为主,但人体只能吸收利用Fe2+。为了限制活性铁的负向作用,体内的铁主要以与其他辅基结合的形式存在。血液中Fe3+与转铁蛋白(Transferrin,TF)结合,从而被运输到各个组织。一般来说,血液循环中会剩余大约三分之二的不饱和转铁蛋白用于抵抗氧化还原反应和有毒非转铁蛋白结合铁的积累[6]。脑缺血后,细胞外铁浓度升高提高了TFR对Fe3+的摄取,并被还原为Fe2+,并由STEAP3和DMT1释放到细胞质中。同时由Tau蛋白介导的APP转运和Fpn1活性降低,限制铁输出。所以铁以不稳定铁池(Labile iron pool,LIP)的形式在细胞内积累[6]。过量的活性铁通过非酶芬顿反应(Fenton)和LOX介导的芬顿反应参与ROS的产生,促成细胞铁死亡。通过对细胞内LIP的调控是通过铁代谢途径调控铁死亡的关键环节。

1.2 脂质过氧化物的清除 众所周知,铁死亡是由细胞内铁过载导致脂质过氧化物大量积累引起的细胞程序性死亡。位于细胞膜的含有多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFAS)的磷脂(PUFA-PLS)经过一系列氧化还原反应形成脂质过氧化物,通过过量积聚而引发铁死亡已被证实。从组成上看,磷脂的化学多样性源于两条脂肪酰基链sn1和sn2,sn1往往结合的是饱和脂肪酸(Saturated fatty acid,SFA)和单不饱和脂肪酸(Monounsaturated fatty acid,MUFA),而sn2在此基础上还可以结合多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid,PUFA)[8]。结合了PUFA的细胞膜磷脂虽然实现了许多细胞功能,但也增加了对铁死亡的敏感性。

PUFA含有双烯丙基,不同于单不饱和脂肪酸的烯丙基和饱和脂肪酸的没有双键的亚甲基,由于位于两个碳-碳双键中间而键能减小,该亚甲基基团非常容易发生过氧化。自由基从PUFA的双烯丙基中去除氢原子从而产生磷脂自由基(PLOO·)[9],随后从另一个PUFA中去除氢,形成磷脂氢过氧化物(PLOOH)。

1.3 调控铁死亡的主要细胞通路

1.3.1 System Xc-/GPX4途径:System Xc-是一种胱氨酸/谷氨酸盐反转运体,其表达编码的蛋白被称为xCT蛋白,该蛋白使细胞恢复氧化还原稳态并在氧化应激、氨基酸饥饿、代谢应激和基因毒性应激等压力条件下提高细胞生存率[10]。胱氨酸在细胞内发生氧化还原反应变成半胱氨酸,并与谷氨酸、甘氨酸结合成为GSH。GPX4是著名的细胞铁死亡抑制蛋白,可以利用还原型谷胱甘肽清除自由基,催化PLOOH还原为相应的羟基衍生物来保护细胞[11]。目前有关于肿瘤细胞的研究发现通过靶向干预GPX4上游通路来降低其活性可以达到诱导肿瘤细胞铁死亡的目的从而提高疗效[12]。SLC1A5是一种在许多癌症中表达水平较高的铁死亡相关基因(FRGS),在有关神经胶质瘤的研究中,有人发现SLC1A5在胶质母细胞瘤组织中表达显著上调,增加GPX4表达从而抑制胶质瘤铁死亡[13]。

1.3.2 FSP1/CoQ10途径:铁死亡抑制蛋白 1(Ferroptosis suppressor protein 1,FSP1)又被称为线粒体相关细胞凋亡诱导因子 2(Apoptosis-inducing factor 2,AIFM2)[10],是一种依赖于烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP) 的辅酶 Q10 氧化还原酶。FSP1通过豆蔻酰化修饰定位于质膜从而作为氧化还原酶来还原辅酶Q10(CoQ10)。CoQ10不仅保护细胞线粒体呼吸链,其抗氧化作用还能中和膜的自由基,抑制CoQ10会加速细胞的铁死亡[14]。

1.3.3 Nrf2/HO-1途径:核因子E2相关因子2(Nrf2)是一种亮氨酸拉链转录激活因子[15]。Nrf2可以激活醌氧化还原酶-1[NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1,NQO1]、血红素加氧酶-1(Heme oxygenase 1,HO-1)和铁蛋白重链-1(Ferritin heavy chain 1,FTH1)的转录。HO-1是一种抗氧化酶,主要用于催化血红素分解代谢成为亚铁、一氧化碳和胆绿素[16]。血红素的降解有助于抗氧化作用,副产物胆绿素及其还原型胆红素具有ROS清除活性,这些作用对于HO-1清除过氧化物及羟基自由基有很大帮助。

1.3.4 DHODH/CoQ10途径:在线粒体内膜上,DHODH将二氢乳清酸(DHO)还原为乳清酸(ORO),并将电子转移到FMN并转化为二氢黄素单核苷酸(Dihydroflavin monucleotide,FMNH2),然后将乳清酸转化为尿苷一磷酸(UMP),即参与核糖体生物合成的 RNA 核苷酸。ZHANG等[16]使用MnCl2干预肿瘤细胞引发铁死亡,同时MnCl2下调肿瘤细胞中的DHODH表达,导致线粒体ROS和脂质过氧化的增加,恢复DHODH表达则可以逆转这种情况,证明DHODH是一个可靶向弱点。

1.3.5 GCH1/BH4/磷脂途径:GCH1是四氢生物蝶呤(BH4) 生物合成的限速酶,可以响应三个梯队的铁死亡诱导剂(RSL3,erastin和GPX4基因消融)。KRAFT等[17]在CRISPR 激活筛选中发现一组拮抗铁死亡细胞死亡的基因,包含GTO环水解酶-1(GCH1)以及GCH1的代谢衍生物四氢生物喋呤/二氢生物喋呤(BH4/BH2)。GCH1的表达通过两种机制来抑制铁死亡:①GCH1 产生功能类似于 CoQ10的亲脂性抗氧化剂 BH4,以防止脂质过氧化;②GCH1通过脂质膜环境重塑来增加还原型 CoQ10 的丰度,并消耗增加对铁死亡敏感性的 PUFA-PLs。值得注意的是,GCH1可以选择性地保护具有两个多不饱和脂肪酰基尾的磷脂免于降解,表明GCH1/BH4/磷脂途径可能是治疗的潜在靶点。

2 脑缺血再灌注损伤

缺血性脑卒中是由于局部脑缺血及永久性脑梗死引发的突发神经功能缺损[18],包括短暂性脑缺血发作(TIA)及缺血性脑梗死(Ischemic stroke,IS),是全球第二大死亡原因和第三大残疾原因。常见病因包括大动脉的动脉粥样硬化闭塞、脑栓塞(栓塞性梗死)、小的深部穿支动脉的非栓塞性梗塞(腔隙性脑梗)和由远端动脉狭窄及脑血流下降导致的分水岭区域梗死(血流动力学卒中)。

FDA目前仅批准静脉组织纤溶酶原激活剂和血管内血栓切除术作为脑梗死治疗方法。但是两种治疗方法必须分别在中风后4.5 h和12 h内使用,非常紧迫。去除血栓后,血液的复通也会对患者造成损伤,称为脑缺血/再灌注损伤(Cerebral ischemia/reperfusion injury,CIRI),目前脑缺血再灌注引起损伤的机制是复杂的,尚不完全明确,涉及多个信号通路。恢复期CIRI包括多种复杂的病理生理过程,比如兴奋性氨基酸的毒性作用、自由基损伤、Ca2+超载、炎症反应、能量代谢失常,这些多环节快速级联反应都会对神经元造成损伤。

3 铁死亡与脑缺血再灌注

铁死亡是造成缺血再灌注损伤的机制之一,再灌注后一般都伴随ROS过量生成以及铁的积累。过量的Fe2+发生芬顿反应(Fenton)产生羟基自由基[19],从而引起细胞毒性。脑微血管内皮细胞(BMVEC)功能障碍,ROS积累引起巨噬细胞大量增多,血脑屏障(BBB)受损,出现脑梗死后出血性转化和脑水肿[20],以及早期神经功能恶化。在MCAO大鼠中敲低 CBX7 会降低铁离子浓度和转铁蛋白受体 1(Transferrin receptor 1,TFR1) 的蛋白表达,但会增强SLC7A11 和GPX4通路,从而抑制铁死亡,从而减轻脑缺血再灌注损伤、改善认知功能障碍并通过激活Nrf2/HO-1信号通路抑制铁死亡[21]。WANG等[22]提出线粒体铁蛋白(FtMt)可以通过抑制炎症调节的铁沉积来减轻神经元的铁死亡,进一步发现FtMt过表达可以减轻缺血再灌注引起的血脑屏障破坏。CISD2(CDGSH iron-sulfur domain-containing protein 2)是一种早期神经元分化的标志,过去有研究发现沉默CISD2可提高头颈部肿瘤细胞对铁死亡诱导剂磺胺吡啶的敏感性,过表达CISD2则相反,胡淼的研究表明,过表达CISD2可以抑制TFR1的表达从而限制铁的运输,从源头上抑制受损神经细胞对铁的过度转运,从而减少脂质过氧化物的产生[22],为缺血性脑卒中的治疗提供了一个可靶向的思路。

与此同时许多研究表明,铁螯合可以减少动物的缺血再灌注损伤[24]。Nrf2是重要的铁死亡抑制基因。ZHANG等[25]通过向脑室内注射miRNA-27a激动剂或拮抗剂改变miRNA-27a表达水平,并建立MCAO模型,检测发现miRNA-27a 靶向抑制 Nrf2,加剧细胞铁死亡。并且拮抗miRNA-27a可以逆转这种作用,表明miRNA-27a可能通过抑制Nrf2来加重缺血性脑卒中期间因再灌注引起的脑组织死亡。缺血性脑卒中发病后,内源性修复机制介导的可塑性变化可以促进大脑皮层功能如神经胶质增生、突触功能重建、髓鞘再生和神经干细胞激活的改善。去铁胺(Deferoxamine,DFO)是美国食品药品监督管理局(FDA)批准应用的铁螯合剂,合成脂质体包裹将亲水性药物包裹在中间,亲脂性药物包被在膜上,从鼻内给药,可以使药物更好地透过血脑屏障。GUO等[26]使用合成脂质体包裹的去铁胺(DFO-LIP)纳米颗粒发现铁沉积的减少可以逆转卒中后大脑皮层功能的变化,延迟神经功能的恢复,研究人员又使用纳米脂质体包裹的柠檬酸铁胺(FAC-LIP)尝试提高铁水平能否促进皮层功能改善,但是并未见到预期结果。他们推测可能需要一定的铁水平才能促进大脑皮层神经功能的恢复[27]。

酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)是PUFAs代谢的重要同工酶,将辅酶A(Coenzyme A,CoA) 酯化为游离脂肪酸,并且酰基辅酶A(Acyl-CoA)的形成激活相应的脂肪酸进行脂质过氧化[28]。通过过表达ACSL4可以通过催化多种多不饱和脂肪酸提高细胞对于铁死亡的敏感性。CUI等[29]进一步研究发现在大脑中动脉闭塞后缺氧诱导因子1α(HIF-1α)通过调节脂质代谢介导了ACSL4表达的抑制。推广研究发现ACSL4可以促进小胶质细胞介导的炎症反应,这也是缺血性卒中神经炎症的重要原因之一。而抑制或敲除ACSL4可以保护细胞免受铁死亡,降低卒中后神经细胞的损伤。

大脑缺血缺氧时三磷酸腺苷(ATP)的减少会导致Na+/K+电化学梯度崩溃,导致谷氨酸转运蛋白反向运行,并且有研究证明由System Xc-介导的突触外谷氨酸释放是造成缺血缺氧时胞外谷氨酸浓度升高和兴奋性毒性的关键机制之一。HSIEH等[30]提出缺氧诱导因子1α(HIF-1α)可以直接通过糖氧剥夺/再氧合(Oxygen glucose deprivation/re-oxygenation,OGD/R)依赖性方式结合于xCT启动子来调节xCT的转录,从而增加谷氨酸的转运,增强氧化应激毒性。

4 结 语

缺血性脑卒中引发的神经细胞损伤及后续的再灌注损伤使其成为了危害全球人类健康的元凶之一。铁死亡作为一种新近发现的细胞程序性死亡方式在很长时间内都是医学研究的热点,有越来越多的研究者发现其在各种疾病损伤中发挥的作用,例如在肿瘤细胞中有效地诱导铁死亡可以提高肿瘤的治愈率,在急性肺损伤或者脑缺血再灌注损伤中抑制细胞铁死亡可以减少损伤并保护组织。因此通过靶向细胞通路来抑制细胞铁死亡从而提高脑缺血再灌注后神经细胞存活率是非常有意义的。本文的不足在于铁死亡的细胞通路是如同树的根系一般非常庞大的,在此只能叙述各个通路位于上游的调节部分,继续向下游探索会发现铁死亡的作用靶点非常丰富,并且各个通路之间还可以通过相互作用进行调节。随着对细胞铁死亡各种通路及影响因素探索的不断加深,可以帮助我们揭开脑缺血再灌注这一病理过程细胞组织病变的神秘面纱,为临床缓解患者痛苦,提高治疗效率提供新的思路。