胶质细胞系源性神经营养因子/胶质细胞系源性神经营养因子受体信号通路在乳鼠先天性巨结肠相关性小肠结肠炎中的作用实验研究

牛志新,何 峰,宋春光,肖玉清

(1.秦皇岛市第一医院肛肠科,河北 秦皇岛 066000;2.青龙满族自治县医院外二科,河北 秦皇岛 066500)

先天性巨结肠(Hirschsprung’s disease,HD)是外科常见小儿消化道畸形,主要以结肠远段神经节细胞缺失引起便秘、腹胀及肠梗阻等为主要表现[1-2]。HD相关性小肠结肠炎(Hirschsprung-associated enterocolitis,HAEC)是HD常见并发症,是导致HD患儿死亡的主要原因之一[3-4]。目前有关HAEC发病机制尚未明确,研究表明,免疫功能低下、肠黏膜屏障炎性损伤、菌群失调等均是影响HAEC发病的相关因素,但都不能完全解释HAEC发生机制[5-6]。研究显示,肠神经系统改变在HAEC发生发展中发挥关键作用[7],但具体分子机制尚不十分清楚。胶质细胞系源性神经营养因子(Glial cell line derived neurotrophic factor,GDNF)是由神经胶质细胞分泌的营养因子,大量存在于胃肠道平滑肌中,其生物信息介导主要通过与其受体(GDNF family receptor alpha 1,GFRα1)、酪氨酸酶受体(Receptor tyrosine kinase,RET)协同作用促进神经元生长、保护肠黏膜,促进肠道蠕动,对慢传输型便秘有一定改善作用[8-10]。目前有关GDNF/GFRα1信号通路在HAEC中的作用研究少见报道,因此本研究建立HAEC乳鼠模型,探讨GDNF/GFRα1信号通路在HAEC中的作用,以期为完善HAEC病理生理过程有效治疗HAEC提供一定理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 16只SPF级SD雌雄各半内皮素受体B基因(Endothelin receptor B,Ednrb)敲除乳鼠(B6-129),体重18～26 g,平均(21.06±3.57)g,购买自华中科技大学同济医学院实验动物中心[动物合格批号:SCXK(湖北)2014-0004]。

1.2 HD乳鼠模型建立及分组 鉴定出Ednrb基因敲除乳鼠基因后,筛选出杂合乳鼠,杂合乳鼠杂交获得纯合乳鼠。21日龄纯合乳鼠为HD模型组(实验组),同日龄野生型乳鼠为对照组,8只/组。

1.3 肠道组织标本采集 将21日龄的两组乳鼠以脊髓脱臼法处死,取结肠组织冲洗干净,依据肠管形态将实验组标本分为狭窄段、扩张段,对照组标本相应分为远段、近段。每段标本均分4部分,分别用于苏木精-伊红(HE)染色、酶联免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assey,ELISA)检测白介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α);免疫印迹(Wb)法蛋白检测。

1.4 HE染色及HAEC判定 乳鼠结肠组织标本经多聚甲醛固定、石蜡包埋、KH-Q350型病理组织切片机(购自湖北孝感阔海医疗科技有限公司)切片(6 μm厚)并脱蜡水化,进行HE染色(试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司),以中性树胶封片,OLYMPUS CX23型光学显微镜(购自上海普赫光电科技有限公司)下观察组织病理学变化,并拍照。肠道组织炎症损伤程度采用Teitelbaum等[11]标准进行评估,病理评分≥Ⅲ级定为HAEC,用于后续实验。

1.5 ELISA法检测结肠组织中IL-10、TNF-α水平检测 将实验组、对照组组织标本置于kimble微量组织匀浆器(购自上海研卉生物科技有限公司)中,加入少量生理盐水,充分匀浆,离心10 min(800 g),取上清。严格按照IL-10、TNF-α ELISA试剂盒说明书(均购自无锡云萃生物科技有限公司)测定IL-10、TNF-α水平。

1.6 结肠组织中GDNF/GFRα1通路相关蛋白表达检测 采用WB法测定结肠组织中GDNF/GFRα1通路相关蛋白表达。加入裂解液提取实验组、对照组结肠组织总蛋白,用BCA蛋白定量试剂盒(购自北京伊塔生物科技有限公司)检测蛋白浓度及纯度。电泳、转膜、封闭,加入兔抗鼠GDNF、GFRα1、RET、核转录因子κB p65(NF-κB p65)、TNF-α及内参β-actin多克隆抗体(均购自美国Abcam公司)一抗,1∶500稀释比,4 ℃过夜。加入HRP标记的山羊抗兔二抗(购自美国Abcam公司)(1∶1000)孵育2 h。曝光显影、成像,采用Image J软件进行分析。

2 结 果

2.1 实验组、对照组乳鼠结肠组织病理学变化 实验组结肠狭窄段肌间、神经丛未见神经节细胞,神经丛显著增厚且失去正常形态;而扩张段神经细胞数目增多、形态正常。对照组各肠段神经细胞结构正常、胞质丰富、数量较多。炎症损伤病理评分显示:对照组乳鼠结肠远段、近段均为0级;实验组8只乳鼠结肠狭窄段为Ⅱ级或以下,而扩张段为Ⅲ级或以上为HAEC,说明HAEC主要发生在结肠扩张段。

2.2 两组乳鼠结肠组织IL-10、TNF-α水平比较 对照组乳鼠结肠组织远段、近段IL-10、TNF-α水平比较均无统计学差异(均P>0.05);实验组乳鼠结肠组织扩张段IL-10水平显著低于狭窄段,TNF-α水平显著高于狭窄段(均P<0.05)。见表1。

表1 两组乳鼠结肠组织IL-10、TNF-α水平比较

2.3 两组乳鼠结肠组织GDNF/GFRα1通路相关蛋白表达比较 对照组乳鼠结肠组织远段、近段GDNF、GFRα1、RET、NF-κB p65、TNF-α蛋白表达水平比较均无统计学差异(均P>0.05);实验组乳鼠结肠组织扩张段GDNF、GFRα1、RET蛋白表达均显著低于狭窄段(均P<0.05),NF-κB p65、TNF-α蛋白表达均显著高于狭窄段(均P<0.05)。见表2。

表2 两组乳鼠结肠组织GDNF/GFRα1通路相关蛋白表达比较

3 讨 论

HAEC是HD常见严重并发症,可发生在疾病任何时期,多出现腹胀、腹痛、高热等,若未得到及时治疗将给患儿生命带来严重威胁[12]。目前有关HAEC病理生理机制尚未完全明确,临床尚无确切治疗方式,因此探究HAEC具体机制对其预防及治疗有重要意义。

Ednrb基因敲除的纯合乳鼠模型是研究HD肠炎发病机制的常用模型,表现为远端结肠细小、近端扩张显著,尤在乳鼠21日龄时表现明显,且与野生型比较体重较轻。本研究HD模型建立成功并筛选出HAEC乳鼠进行后续实验。研究表明肠神经系统异常及炎症反应是HD主要发生原因[13-14]。IL-10是抗炎因子之一,由巨噬细胞、树突状细胞等产生,能够通过抑制炎症因子及其受体表达、活化发挥抗炎作用[15-16]。本研究显示,与HAEC乳鼠结肠狭窄段比较,扩张段IL-10水平显著升高,与陈锋等[17]研究结果一致,说明结肠狭窄段与扩张段炎症反应程度不同,可能与抗炎因子IL-10水平高低有关。

胃肠道蠕动受肠神经系统调节,肠壁内神经节细胞发育依赖其神经营养因子的支持、维护,其中GDNF是成熟肠神经胶质细胞分泌产生的营养因子,GFRα1、RET是与神经节细胞发育、迁移有关的功能因子,是神经节发育主要的信号传输系统[18-19]。SORET[8]研究显示,先天性直肠肛门畸形患儿的直肠末端中神经营养因子GDNF、GFRα1和RET水平异常低表达可能与直肠肛门畸形术后排便功能障碍关系密切。金曼等[20]动物实验研究显示,促进GDNF/GFRα1/RET信号通路活化可对慢传输型便秘大鼠结肠组织发挥保护作用。既往研究显示,GDNF与GFRα1结合形成复合物后,再与RET相互作用可激活磷脂肌醇3-激酶(Phosphatei-dylinositol 3 kinase,PI3K),活化产生第二信使PIP3,进一步磷酸化蛋白激酶B(Serine-threonine kinase,AKT)蛋白的Thr308位点,促使AKT活化,而活化的AKT发生磷酸化,抑制下游靶基因NF-κB的转录活性,而NF-κB是一种氧化应激转录因子,主要以p50/p65二聚体形式与其抑制蛋白(Inhibitor kappa,I-κB)形成复合体存在于正常细胞中,在细胞因子刺激下p50/p65二聚体与I-κB发生解离并转移至细胞核中,进而调控多种炎性介质如IL-6、TNF-α等的转录表达,造成细胞DNA损伤或突变,促使炎症反应及进展[21-23]。既往动物实验研究显示,促进GDNF/PI3K/AKT信号通路激活可明显改善功能性便秘乳鼠胃肠动力,并减轻炎症反应[24-25]。本研究结果显示,实验组乳鼠结肠组织扩张段GDNF、GFRα1、RET蛋白表达均显著低于狭窄段,NF-κB p65、TNF-α蛋白表达均显著高于狭窄段,且炎症较重,与既往相关研究结果一致,说明HAEC乳鼠炎症反应主要发生在扩张段,可能与GDNF/GFRα1/RET/NF-κB信号通路受抑制,肠神经调节系统异常有关。

综上所述,HAEC乳鼠结肠扩张段炎症相对较重,可能与GDNF/GFRα1信号通路及相关蛋白表达受抑制,肠神经免疫调节系统异常有关,而具体分子机制有待进一步探究。