山奈酚对缺氧/复氧损伤诱导心肌细胞凋亡的影响及机制研究

武金盼,陈继军,袁 青,赵新春,何佩娟

(空军军医大学西京医院,陕西 西安 710032)

心肌缺血再灌注损伤(Ischemia reperfusion injury,IRI)发生机制复杂,其中心肌细胞在损伤后由于钙超载引发的凋亡发挥重要作用[1-2]。山奈酚属于黄酮类化合物,广泛存在于多种草药中[3]。目前已有报道,山奈酚可减少缺氧损伤、氧化应激损伤及炎症刺激诱导的心肌细胞凋亡[4-6]。也有研究证实,山奈酚能够通过抗炎作用增加缺氧/复氧损伤后心肌细胞的活性[7]。本研究利用缺氧孵箱和常规孵箱交替培养大鼠H9C2心肌细胞建立心肌细胞IRI模型,探究山奈酚对心肌细胞缺氧/复氧损伤诱导心肌细胞凋亡的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 DMEM细胞培养基、胰蛋白酶和10%胎牛血清等细胞培养试剂购自美国Gibco公司;山奈酚购自成都德斯特生物公司;流式细胞仪凋亡检测试剂膜联蛋白Annexin V和碘化丙锭(Propyl iodide,PI)购自江苏博瑞金公司,镜下凋亡检测转移酶介导的缺口末端标记(Transferase-mediated nick-end labeling,TUNEL)购自南京舟达生物科技公司;凋亡相关抗体anti-CASP3、anti-Bax、anti-Bcl-2和anti-GAPDH购自美国Abcam公司,钙离子通道核心蛋白抗体anti-Cav1.2购自美国Alomone公司;细胞核荧光染料Hoechst33342和钙离子荧光标记染料Fluo-4M购自上海博瑞德生物公司。常规细胞孵箱和缺氧孵箱(德国贺氏公司),流式细胞仪(美国赛默飞公司),荧光显微镜(日本奥林巴斯公司),电泳仪及发光仪(上海天能公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养:H9C2大鼠心肌细胞来自空军军医大学航空航天生理学教研室惠赠。用含10%胎牛血清的DMEM培养基在常规孵箱中培养H9C2大鼠心肌细胞[8]。

1.2.2 造模、分组和给药:利用缺氧孵箱和常规孵箱交替培养细胞,建立H9C2大鼠心肌细胞IRI(缺氧/复氧损伤)模型:利用缺氧孵箱(氧浓度为1%)培养细胞4 h后将细胞放入常规孵箱(氧浓度为21%)继续培养4 h,以此方法建立IRI细胞模型[9]。

利用随机数字法将H9C2大鼠心肌细胞随机分为对照组、缺氧/复氧组和山奈酚组,对照组细胞在常规细胞孵箱中常规培养,缺氧/复氧组细胞按照上述造模方法培养,山奈酚组细胞是在缺氧孵箱培养H9C2大鼠心肌细胞4 h后,将培养基更换为含有30 μmol/L山奈酚的培养基[4-7],随后放入常规孵箱继续培养4 h。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡:利用胰蛋白酶收集各组细胞,离心后洗涤细胞3次,再次离心后利用无水乙醇固定细胞1 h,滤网过滤细胞后,利用染料Annexin V和PI避光反应30 min,调试流式细胞仪参数,激光波长为488 nm,发射波长为630 nm,上机检测[10-11]。

1.2.4 TUNEL检测细胞凋亡:利用TUNEL染色法对大鼠心肌细胞进行凋亡检测,培养细胞清洗后利用蛋白酶K工作液在37 ℃下反应30 min,清洗后利用过氧化氢室温反应10 min,清洗好细胞后利用TUNEL反应液在37 ℃下避光反应60 min,清洗后加入带有荧光标记的反应液继续反应,随后封片在荧光显微镜下观察[10-11]。

1.2.5 蛋白表达检测:利用Western blot技术检测大鼠心肌细胞凋亡相关蛋白和钙离子通道核心蛋白Cav1.2含量。利用蛋白裂解液裂解各组H9C2大鼠心肌细胞,在上述样品中加入缓冲液,煮沸获取蛋白样品。经过电泳、转膜、抗体孵育、发光等步骤后检测蛋白含量[12]。anti-CASP3抗体按照1∶1000稀释,anti-Bax抗体按照1∶5000稀释,anti-Bcl-2抗体按照1∶5000稀释,anti-GAPDH抗体按照1∶10000稀释[10-11]。

1.2.6 细胞内钙离子浓度[Ca2+]i检测:利用钙离子特异性荧光染料Fluo-4M标记各组心肌细胞,而后在荧光显微镜下记录各组细胞荧光强度以此检测[Ca2+]i。将各组细胞清洗3遍,加入Fluo-4M工作液,避光室温孵育30 min,孵育后洗涤3遍,避光下荧光显微镜观察并记录[12]。

1.3 统计学方法 利用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析,两样本间比较利用独立样本t检验,三个样本比较采用方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 流式细胞仪检测山奈酚对缺氧/复氧损伤大鼠心肌细胞凋亡的影响 与对照组比较,缺氧/复氧组大鼠心肌细胞凋亡增加(P<0.05);与缺氧/复氧组比较,山奈酚组大鼠心肌细胞凋亡减少(P<0.05)。见图1。

注:A为流式细胞仪检测大鼠心肌细胞凋亡情况。B为各组凋亡情况统计图;与对照组比较,*P<0.05;与缺氧/复氧组比较,#P<0.05

2.2 TUNEL检测山奈酚对缺氧/复氧损伤大鼠心肌细胞凋亡的影响 与流式细胞检测相似,与对照组比较,缺氧/复氧组大鼠心肌细胞凋亡增加;与缺氧/复氧组比较,山奈酚组大鼠心肌细胞凋亡减少。见图2。

图2 TUNEL染色检测山奈酚对缺氧/复氧损伤大鼠心肌细胞凋亡的影响(×40)

2.3 山奈酚对缺氧/复氧损伤大鼠心肌细胞凋亡相关蛋白表达的影响 与对照组比较,缺氧/复氧组大鼠心肌细胞CASP3和Bax蛋白表达增加,而Bcl-2表达减少(均P<0.05);与缺氧/复氧组比较,山奈酚组大鼠心肌细胞CASP3和Bax蛋白表达减少,而Bcl-2表达增加(均P<0.05)。见图3。

注:A为凋亡相关蛋白表达灰度图。B为凋亡相关蛋白相对含量统计图;与对照组比较,*P<0.05;与缺氧/复氧组比较,#P<0.05

2.4 山奈酚对缺氧/复氧损伤大鼠心肌细胞钙离子通道蛋白Cav1.2表达的影响 与对照组比较,缺氧/复氧组大鼠心肌细胞钙离子通道蛋白Cav1.2表达增加(P<0.05);与缺氧/复氧组比较,山奈酚组大鼠心肌细胞Cav1.2表达减少(P<0.05)。见图4。

注:A为钙离子通道蛋白Cav1.2表达灰度图。B为Cav1.2蛋白相对含量统计图;与对照组比较,*P<0.05;缺氧/复氧组比较,#P<0.05

2.5 山奈酚对缺氧/复氧损伤大鼠心肌细胞[Ca2+]i的影响 与对照组比较,缺氧/复氧组大鼠心肌细胞[Ca2+]i增加;与缺氧/复氧组比较,山奈酚组大鼠心肌细胞[Ca2+]i减少。见图5。

图5 山奈酚对缺氧/复氧后大鼠心肌细胞[Ca2+]i的影响(Fluo-4M染色,×40)

3 讨 论

在缺氧孵箱普及之前,心肌细胞缺氧/复氧损伤的细胞模型造模方法主要是在细胞培养时加入耗氧剂连二亚硫酸钠,以此阻断细胞的呼吸链,从而模拟细胞的缺氧状态,但耗氧剂的细胞毒性作用强,且并不能完全模拟缺氧状态。而通过细胞培养箱本身含氧量的调节不仅能够模拟真实情况下的细胞缺氧/复氧状态,还减少了其他因素对细胞生物学状态的影响[9,13]。

凋亡的发生在心肌细胞缺氧/复氧损伤过程中发挥重要作用,控制心肌细胞凋亡可有效减少心肌细胞缺氧/复氧损伤及保护心肌细胞功能[14-15]。研究报道,山奈酚能够通过抗凋亡发挥神经保护和骨保护作用[16-17]。本研究通过流式细胞仪、TUNEL染色和凋亡蛋白检测等多种实验方法从多个角度证实了,山奈酚能够明显减少缺氧/复氧损伤大鼠心肌细胞凋亡,这和之前研究结果一致。有学者报道,山奈酚可有效减少缺氧损伤、氧化应激损伤及炎症刺激等多种不良条件诱导的心肌细胞凋亡[4-6]。但在胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌等多种肿瘤研究方面,山奈酚却表现出了诱导凋亡的能力[18-21]。推测山奈酚对凋亡调控作用的不同可能主要因为细胞来源的异质性,对正常组织细胞山奈酚具有减少凋亡的作用,而对于肿瘤细胞其具有诱导凋亡的作用[22-25]。

心肌细胞缺氧/复氧损伤后凋亡的发生机制复杂,损伤后出现的钙超载发挥关键作用[1,26-30]。心肌细胞内游离钙离子的来源主要有外钙内流和内钙释放,钙超载的发生主要是由于外界刺激引起心肌细胞主要的钙离子通道(电压依赖型钙离子通道)的开放,使得外钙内流增加,进一步刺激细胞内的钙库释放,导致[Ca2+]i升高,激活凋亡通路,诱导细胞凋亡的发生[31-34]。本研究发现,缺氧/复氧损伤刺激后心肌细胞上电压依赖型钙离子通道的核心蛋白Cav1.2表达升高,心肌[Ca2+]i也大幅升高,也证实了钙超载在心肌细胞缺氧/复氧损伤后凋亡中的关键作用。而山奈酚干预后缺氧/复氧损伤诱导的钙离子通道核心蛋白Cav1.2和[Ca2+]i增加都得到一定程度的抑制。本研究主要在体外验证上述结论,后续实验中我们将在体研究山奈酚对心肌IRI诱导凋亡的作用及机制。

综上所述,山奈酚可能通过减少钙离子通道蛋白Cav1.2表达和胞内钙离子浓度抑制缺氧/复氧损伤诱导的大鼠心肌细胞H9C2凋亡。本研究不仅拓展了山奈酚在不同疾病模型上的应用,而且为开放新型治疗心肌IRI药物提供了一定的实验基础。