黑白中药通过调节MC1R和RTKs的表达对黑色素代谢的影响研究

杨波涛 贾桂云 陈鲲 吴跃文 杨柳 查旭山

[摘要]目的：探討首乌、女贞子等七味黑色中药和白及、白芷等七味白色中药对豚鼠皮肤组织黑色素合成中黑皮质素1受体（Melanocortin 1 receptor，MC1R）、受体酪氨酸激酶（Receptor tyrosine kinase，RTKs）表达的影响。方法：采用水提法获得中药提取物，用灌胃的方法以14 d为周期等量灌胃豚鼠获得背部皮肤组织，采用免疫组化及免疫荧光法检测实验和对照组MC1R、RTKs蛋白的表达，用Image J软件统计分析结果，比较不同中药环境对豚鼠皮肤组织的黑色素合成的影响，分析MC1R、RTKs蛋白与黑素细胞代谢三者的变化关系。结果：对MC1R蛋白有抑制作用的白药有白芷、白茯苓、白蔹、白及、白僵蚕、白术，其中白芷、白僵蚕、白术的作用最为明显，对MC1R有明显抑制作用的黑药有乌梅、黑芝麻、丹参、鸡血藤，其中丹参的抑制作用最为明显。该结果显示上述10味中药对黑色素合成有抑制作用，其中白芷、白僵蚕、白术、丹参的抑制作用最为明显。其中对于RTKs蛋白有抑制作用的白药有白芷、白茯苓、白蔹、白及、白僵蚕，其中白茯苓、白蔹、白及的作用最为明显，具有明显作用的黑药有黑芝麻、丹参，其中丹参的作用最为明显。结论：药材颜色与药效之间有一定关系；黑白中药都对MC1R及RTKs蛋白有不同程度的抑制作用，色象中药可能通过调节α-黑素细胞剌激素/黑皮素1受体（Alpha-melanocyte stimulating hormone/Melanocortin 1 receptor，α-MSH/M1CR）、干细胞生长因子/受体酪氨酸激酶（Stem cell growth factor/Receptor tyrosine kinase，SCF/RTKs）信号通路来影响黑素细胞代谢。

[关键词]中药色象理论；黑白中药；黑素细胞；黑皮质素1受体；受体酪氨酸激酶

[中图分类号]R285    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2024）03-0012-05

Study on the Effect of Black and White Chinese Medicine on Melanin Metabolism by Regulating the Expression of MC1R and RTKs

YANG Botao1，2，JIA Guiyun3，CHEN Kun3，WU Yuewen2，YANG Liu4，ZHA Xushan1

（1.Department of Dermatology，the First Clinical Medical College of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510405，Guangdong，China; 2.Department of Dermatology，Nanhai Hospital， Guangdong Provincial People's Hospital，Foshan 510251，Guangdong，China; 3.School of Life Sciences，Guangzhou University，Guangzhou 510006，Guangdong，China; 4.School of Traditional Chinese Medicine，Southern Medical University，Guangzhou 510515，Guangdong，China）

Abstract： Objective  To investigate the effects of seven black Chinese herbs， such as Polygonum multiflorum Thunb， and Ligustrum lucidum， and seven white Chinese herbs， such as Bletilla striata and Angelica dahurica， on the expression of melanocortin 1 receptor （MC1R） and receptor tyrosine kinase （RTKs） in melanin synthesis of guinea pig skin. Methods  The extract of traditional Chinese medicine was obtained by water extraction， and the skin tissue of the back of guinea pigs was obtained by gavage of the same amount in a 14 day cycle. The expression of MC1R protein and RTKs protein in the experimental and control groups were detected by immunohistochemistry and fluorescence methods. The results were statistically analyzed by Image J software. The effects of different traditional Chinese medicine environments on melanin synthesis in the skin tissue of guinea pigs were compared， and MC1R The relationship between RTKs protein and melanocyte metabolism. Results  The white herbs with inhibitory effect on MC1R protein are Angelica dahurica， Poria cocos， Ampelopsis japonica， Atractylodes macrocephala， atractylodes macrocephala， among which the effects of Angelica dahurica， Atractylodes macrocephala， Atractylodes macrocephala are the most obvious， and the black herbs with significant inhibitory effect on MC1R are Ophiopogon flexuosus， Nigella sativa， Dangshen， Chickweed， among which the inhibitory effect of Dangshen is the most obvious. This result showed that the above 10 herbs had inhibitory effects on melanin synthesis， among which the inhibitory effects of Angelica dahurica， Cortex alba， Atractylodes macrocephala， and Salvia miltiorrhiza were the most obvious. Among them， the white herbs with inhibitory effect on RTKs protein are Angelica dahurica， Poria cocos， Ampelopsis pilosulae， Bupleurum officinale and Bupleurum officinale， among which Poria cocos， Ampelopsis pilosulae and Bupleurum officinale have the most obvious effect， and the black herbs with obvious effect are Nigella sativa and Salvia miltiorrhiza， among which Salvia miltiorrhiza has the most obvious effect. Conclusion  There is a certain relationship between the color of medicinal materials and their efficacy. Both black and white drugs inhibit the action of MC1R and RTKs protein to varying degrees， and color image Chinese medicine may regulate α- MSH/M1CR and SCF/RTKs signal pathways affect melanocyte metabolism.

Key words： Color-effect phenomenon theory of traditional Chinese herbs; black and white Chinese herbs; melanocytes; melanocortin 1 receptor; receptor tyrosine kinase

中药色象是表明中药材颜色与疗效相关的现象，该理论称为色象理论，而基于该理论的中药称为色象中药[1]，但中药材本身的颜色与药效之间是否存在特定的作用关系，机制尚未阐明。笔者团队从2007-2022年来一直致力于中药色象理论基础研究与临床工作，最近通过观察临床常用治疗白癜风与黄褐斑色象中药以及文献统计分析筛选出最常用的色象中药即黑色与白色中药[2]各七味，提取物灌胃豚鼠后，采用免疫组化及荧光检测并观察实验组和对照组黑素皮质激素受体1（MC1R）蛋白、RTKs蛋白的表达量，分析不同中药环境对豚鼠皮肤组织的黑色素合成影响的原因及其相互作用关系，现报道如下。

1  材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：SPF级成年豚鼠64只，体重约250克/只，均购于广东省动物实验中心。

1.1.2 主要试剂与材料：白芷、白附子、白茯苓、白蔹、白及、白僵蚕、白术、首乌、熟地、乌梅、女贞子、黑芝麻、丹参、鸡血藤共14味中药（均由香港奥美药业股份有限公司提供）、免疫染色固定液、免疫染色洗涤液、RTKs Rabbit Monclonal Antibody、MC1R Rabbit Monclonal Antibody、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H+L）、DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒（均购于碧云天生物技术公司）。电磁炉（购于美的集团股份有限公司）、离心机（Model E3116R，ESSENSCIEN U.S.A.）、粉碎机、载玻片（帆船）、冷冻切片机（Leica，Germany）、荧光倒置显微镜（Nikon，Japan），电子天平（ME203E/02，购于梅特勒-托利多仪器上海有限公司）等。

1.2 实验方法

1.2.1 中药的提取（水提法）：将14味黑白中药分别称取10 g，用粉碎机粉碎成粉末状，分别加入蒸馏水300 ml，浸泡30 min，大火煎煮至沸腾，改用文火煎煮至黏稠。再加150 ml蒸馏水煎煮，重复上述操作两次，室温下静置过夜，次日用4层纱布过滤，得滤液于离心管，5 000 r/min离心15 min，收集上清液后定容至50 ml，分装后-20℃保存。

1.2.2 豚鼠给药及皮肤组织获取：将64只健康豚鼠（实验动物伦理编号：KJ-2019-03-001）按照随机分组的方式分为16组，每组4只，其中两组为对照组，余下14组为实验组。相同条件下饲养1周后实验组每组每只每天灌胃喂养0.5 ml的中药提取液，对照组以同样的方法喂入等量的蒸馏水，连续喂药14 d，每天尽量保证同一时间给药。喂药周期结束后，处死豚鼠，刮去背毛，取其背部约4 cm2的皮肤组织，用液氮迅速冷却后置于离心管中做好标记后在-80℃下储存。

1.2.3 皮肤组织的免疫组化：使用德国Leica冷冻切片机将获取的豚鼠皮肤组织切成10μm的薄片置于载玻片上，滴加免疫染色固定液覆盖组织切片，固定10 min后用免疫染色洗涤液洗涤2～3次，5分钟/次。吸去最后1次洗涤液后立即滴加BSA封闭液室温封闭1.5 h，回收封闭液后立即滴加稀释好的一抗[MC1R抗体或RTKs抗体（均按照1∶200的比例稀释）]室温孵育1.5 h。回收一抗，用洗涤液洗涤3次，6分钟/次，吸去最后一次洗涤液后滴加稀释好的二抗[辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H+L）（按照1∶200的比例稀释）]室温孵育1 h。回收二抗，用洗涤液洗涤3～5次，6分钟/次（整个过程要避免切片干燥，否则极易产生较高的背景），加入配置好的DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒（A液∶B液=1∶1）染色10 min，用蒸馏水洗涤3次。将载玻片置于荧光倒置显微镜下观察荧光，拍照记录结果。

2  结果

2.1 黑白中藥对MC1R蛋白表达的影响：结果显示，对MC1R蛋白有抑制作用的白药有白芷、白茯苓、白蔹、白及、白僵蚕、白术，其中白芷、白僵蚕、白术的作用最明显，见图1。黑药中对MC1R有明显抑制作用的中药有乌梅、黑芝麻、丹参、鸡血藤，其中丹参的抑制作用最为明显，见图2（结果图片来源于广州大学生命科学院）。黑白中药对MC1R蛋白表达影响Image J软件分析结果见图3。

2.2 黑白中药对RTKs蛋白的影响：结果显示，对RTKs蛋白有抑制作用的白药有白芷、白茯苓、白蔹、白及、白僵蚕，其中白茯苓、白蔹、白及的作用最为明显，见图4；具有明显抑制作用的黑药有黑芝麻、丹参，其中丹参的作用最为明显，见图5。黑白中药对RTKs蛋白表达影响Image J软件分析结果见图6。

2.3 黑白中药对豚鼠背部皮肤组织荧光强度与面积的影响分析：结果显示，黑白中药对豚鼠背部皮肤组织MC1R、RTKs荧光强度与面积的影响作用与荧光图片、Image J软件分析结果一致。见表1。

3  讨论

本研究选择经典的黑色素代谢研究方法（含中药血清对体外干预蘑菇酪氨酸酶活性的方法、中药血清干预体外培养人黑素细胞后其酪氨酸酶基因蛋白的表达、黑素合成量）来研究色象中药对色素代谢的影响，保证实验结果的可靠。黑色素的产生与黑素细胞分化紧密相关，分化和色素沉着的产生以各种信号转导途径的激活为标志，这些途径主要导致诱导邻苯二甲酸相关的转录因子Mitf转录。Mitf反过来激活的黑色素合成相关基因如TYIP1，TYRP2，Tyr等基因的分化。研究表明[3-7]，有两种主要途径可控制Mitf的诱导：α-黑素细胞刺激素（α-MSH）/黑皮质素1受体（MC1R）信号传导途径，以及干细胞因子（SCF）/RTKs受体酪氨酸激酶途径。作为对紫外线辐射的急性生理反应，角质形成细胞产生并分泌α-MSH（类似于促肾上腺皮质激素，ACTH）可以与MC1R结合，从而在黑素细胞中启动细胞内cAMP介导的信号级联。活化蛋白反过来激酶A（PKA）磷酸化cAMP反应元件结合蛋白（CREB），导致Mitf的转录激活，从而驱动皮肤色素沉着。而RTKs受体（CD117）是由原癌基因RTKs编码的具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白，它是Ⅲ型受体酪氨酸激酶家族（RTK）的重要成员[8]，SCF/RTKs信号通路调节黑素细胞的增殖和迁移[9-10]。以上都说明α-MSH/M1CR、SCF/RTKs两种信号通路在黑素细胞代谢中起到关键作用。而本实验结果中发现黑白色中药均有不同程度抑制MC1R与RTKs（酪氨酸激酶受体）蛋白的作用，这与之前研究的基础推论一致。黑色素增加与减少与MC1R与RTKs两者关系紧密，呈现一定相关性。

本实验研究从中医传统治验与临床皮肤病治疗的实践中最常应用的治法“以黑治白，以白治黑”入手，选择临床常用于治疗色素障碍性疾病的黑、白两大类中药各7种中药作代表发现了药材本身的颜色（黑药、白药）与药效之间确实存在一定关系，也印证中药色象理论的科学性。而中药颜色与药效关系的机制之一可能是通过调节α-MSH/M1CR、SCF/RTKs信号通路来影响黑素细胞代谢。

本研究存在不足：①现有资料表示仅有白附子和白僵蚕具有毒性。豚鼠皮肤对药物刺激反应灵敏，其反应与人类相似，在饲喂豚鼠的过程中，所有药物的使用剂量对黑色素的合成有抑制作用但并未明显表现出毒性，若后续用于临床研究，则需先进行毒性检测，条件与时间所限本实验暂时未做药物的毒性检查。②本研究只对MC1R以及RTKs蛋白表达做了基础研究，但是对MC1R的凋亡通路以及RTKs蛋白增殖通路包括SCF/RTKs信号传导途径是否有被黑白中药具体影响还值得深入研究。可以看到的是现有研究黑药如黄连、红花等中药的美白已经初具成效[11-12]，白药如白及、白附子等中药美白也在理化研究阶段[13-15]，黑白中药即色象中药在皮肤美容方面拥有较大的发展潜力。

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[收稿日期]2023-01-09

本文引用格式：杨波涛，贾桂云，陳鲲，等.黑白中药通过调节MC1R和RTKs的表达对黑色素代谢的影响研究[J].中国美容医学，2024，33（3）：12-16.