研究表皮黑素细胞与毛囊角质形成细胞在接触性共培养体系中的相互作用

许小标 解士海 杨观招

（广东省惠州市皮肤病医院，广东 惠州516001）

研究表皮黑素细胞与毛囊角质形成细胞在接触性共培养体系中的相互作用

许小标 解士海 杨观招

（广东省惠州市皮肤病医院，广东 惠州516001）

目的研究分析表皮黑素细胞和毛囊角质形成细胞在接触性共培养体系的建立，以及相互作用。方法用胰酶融化游离毛囊与包皮的表皮，获得纯度角度高的角质形成细胞与黑素细胞，第三代毛囊角质形成细胞在6孔板中接种，2 d以后按照表皮黑素细胞与毛囊角质形成细胞之间的比例，按照1∶2、1∶10、1∶20的比例接种黑素细胞，其中在1∶10的比例中，加入-黑素细胞刺激素，在干预6 d以后，用NKI/beteb作一抗。结果以1∶10的接种比例，很符合表皮基底层的黑素细胞与角质形成细胞比例；但是在1∶2情况下可获得数量多的表皮黑素细胞。而在1∶20情况下可以发现角质细胞、黑素细胞之间的联系。结论表皮黑素细胞与毛囊角质形成细胞在接触性共培养体系下，非常适合用于人色素系统方面的研究。

表皮黑素细胞；毛囊角质；细胞；黑素细胞

表皮黑素细胞在人体内的生长常常需要和角质形成细胞合并在一起，共同调节生理性质的黑素细胞和角质形成细胞在培养体系中的比例[1]。用毛囊角质形成细胞研究，能够充分利用增殖能力较强的毛囊角质形成细胞和表皮黑素细胞一起培养，观察不同比例条件下良种细胞生长情况以色素调节剂对黑素细胞的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

头皮与包皮来自整形外科，在包皮环切术中取得。试剂采用华美生物工程公司制造的SP免疫组化检测试剂盒，人黑素细胞培养基，人表皮细胞培养基、质形成细胞、以及黑素细胞生长添加成分都来自Cascade生物公司。

1.2 方法

1.2.1 表皮黑素细胞的培养

将包皮标本放入水中浸泡、冲洗，然后剪掉皮下组织，切成大约（5×3）mm的细条，在分离酶Ⅱ中温度为37 ℃情况下消化2 h左右，分离获得表皮，在胰酶37 ℃条件下消化10 min，过了200 d以后进行筛网过滤，得到单细胞悬液，以完全黑素细胞培养基添加生长大约是5 mL，其主要成分为：氢化可松、胎牛血清等[2]，调整细胞按照6× 105/mL的标准接种，隔2 h以后换液，等到8 d以后黑素细胞形成网状，用胰酶处理，先消化下黑素细胞悬液，残留的贴壁牢固的表皮角质组成细胞，选择纯净表皮黑素细胞，进行培养，第三代细胞作为备用。

1.2.2 毛囊角质形成细胞培养

选用带毛囊的头皮，用碘伏浸泡，用生理盐水冲洗约10 min，清理掉表皮与真皮，把含有毛囊的真皮放在含青霉素400 U/mL与链霉素的培养基中进行漂洗大约10 min，在放进2.4 U/mL的分离酶Ⅱ中，温度设定为37 ℃，进行消化4 h左右，然后观察头皮松散程度，待完全松散后，用医学常用镊子拔出头皮中的毛囊，用浓度为5%的胰酶消化毛囊为5～10 min，经过铜网把毛发的残渣过滤掉，提取出纯粹的单细胞液体，再使用完全的表皮细胞培养出添加的角质，其成分主要为牛胰岛素5 μg/mL、牛转移因子5 μg/mL等，在10 d过后，按照80%的比例融合，含有少量黑素细胞。用胰酶处理，消化掉残留的角质细胞。

1.2.3 接触性共培养

把第3代皮黑素细胞以2.5×104mL、2.5×103mL和5×103mL和第二代毛囊角质形成细胞接种，在生长2 d以后的6孔培养板内，让表皮黑素细胞和毛囊角质形成细胞接种比例约为1∶2、1∶10、1∶20。采用的共培养基是黑素细胞培养基、角质形成细胞培养基形成的混合物，隔两天换一次液，每天认真观察。在共培养体系中选取表皮黑素细胞和毛囊角质形成细胞比例为1∶20的一组，和不添加任何药物的一组进行比较[3]。在培养黑素细胞过程中选用第三代表皮黑素细胞，在不间断进行药物干预，观察黑素细胞形态的变化，当干预6 d以后，取出盖玻片，放入PBS内，过了5 min后，用冷乙醇固定约10 min，进行自然干燥，用NKI/beteb稀释一百倍当作一抗。最后在显微镜下面认真观察后摄片。

2 结 果

表皮黑素细胞培养基以及添加成分比较有利于黑素细胞的贴壁、增殖，在进行换液过程中可以去掉培养基中很多毛囊角质形成的细胞悬浮，基本上不会出现纤维细胞污染的情况。用胰酶处理第二代毛囊角质形成细胞融合效果良好。以1∶10的接种比例，很符合表皮基底层的黑素细胞与角质形成细胞比例；但是在1∶2情况下可获得数量多的表皮黑素细胞。而在1∶20情况下可以发现角质细胞、黑素细胞之间的联系。

3 讨 论

表皮黑素细胞和毛囊角质形成细胞在接触性共培养体系中，非常有利于发挥角质形成细胞对黑素细胞的控制作用，且建立生态体系下的共培养体系，对色素性疾病发病机制研究非常重要。在本次研究中我们发现：①毛囊外根鞘内部出现了大量的角质形成细胞，并且在隆突的位置还出现了没有分化的肝细胞，这些细胞增殖很快[4]。②在毛囊外部生成的黑素细胞较少，相应的污染率低。③采用毛囊标本很方便，医师很容易采集到足量的合适毛囊，进而培养出角质形成细胞[5]。

在本次研究中，角质形成细胞在定植时需要的时间比黑素细胞长，呈小片状的生长方式，在2 d以后再次接种黑素细胞，非常有助于细胞生长。其中黑素细胞：角质形成细胞为1∶20，如果要获得大量的黑素细胞，可选用1∶2的比例，筛选色素调节剂，尽量模拟生理状态，那么在这种情形下接种比例保持1∶10最好。在角质形成细胞的周围黑素细胞呈现树状突出效果更明显，这可能是因为角质形成细胞能够释放一定数量的黑素细胞刺激素，起到促进黑素生成的效果，然后在共培养体系中发挥了更明显的作用。在本次研究中，清晰地看到了在公培养体系下黑素体的3种运转方式，但是有个别囊袋状顶端已经脱离了黑素细胞，这是一种偶然的黑素细胞分裂现象，还是黑素体的新型运转方式，目前尚不明确。总之，表皮黑素细胞与毛囊角质形成细胞在接触性共培养体系下，非常适合用于人色素系统方面的研究。

[1] 江蕾薇,陆洪光.人表皮黑素细胞与角质形成细胞体外共培养模型的构建[J].贵阳医学院学报,2010,2(2):54-55.

[2] 邵丽芳,赵广.黑素细胞功能相关性细胞因子的研究进展[J].中国皮肤性病学杂志,2011,4(5):68-69.

[3] Duval C,Smit NP,Kolb AM,et al.Keratinocytes control the pheo/eumelanin ratio in cultured normal human melanocytes[J]. Pigment Cell Res,2002,15(6):440-446.

[4] Greatens A,Hakozaki T,Koshoffer A,et al.Effective inhibition of melanosome transfer to keratinocytes by lectins and niacinamide is reversible[J].Exper Dermatol,2005,30(6):619-767.

[5] 张汝芝,朱文元,马佳.表皮黑素细胞与毛囊角质形成细胞性共培养方法的建立[J].中华皮肤科杂志,2006,39(10):596-598.

R329.4

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1671-8194（2014）11-0066-02