龙眼肉调节肠道菌群和BDNF-TrkB通路抗AD的作用机制研究△

李红艳，雷天荣，岳德琼，赵晨阳，张晗，李昶，杨静娴

1.辽宁中医药大学，辽宁 大连 116600；

2.河北平安健康集团股份有限公司，河北 石家庄 050000

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种以记忆和认知功能障碍为主要临床表现的神经退行性疾病，目前尚无理想治疗策略。运用中医药多靶点和整体调节优势对AD 进行早期预防与治疗至关重要[1]。龙眼肉是无患子科植物龙眼Dimocarpus longanLour.的假种皮，有补益心脾、养血安神功能[2]。据报道，龙眼肉能提高AD 小鼠的学习记忆能力[3]；本课题组前期研究表明，龙眼肉能抑制脾虚痴呆小鼠的病理进程[4]。由于脾虚与肠道菌群失调互为因果[5]，笔者推测肠道菌群可能是龙眼肉抗AD 的作用靶点。基于前期基础和文献分析，本研究拟通过AD 小鼠模型联合16S-rDNA 测序探讨龙眼肉抗AD的作用与肠道菌群的相关性，并通过检测脑源性神经营养因子（BDNF）-酪氨酸激酶受体B（TrkB）通路关键蛋白表达，探究龙眼肉抗AD的分子机制。

1 材料

1.1 实验动物

无特定病原体（SPF）级KM 小鼠30 只，体质量18～22 g，雌性，购于辽宁长生生物科技有限公司，实验动物质量认证许可证号：SCXK（辽）2020-0001，合格证证号：210726221101473418，动物实验经辽宁中医药大学实验动物伦理委员会批准（批准文号：21000042021133）。

1.2 样品

龙眼肉购于安徽益生源中药饮片科技有限公司，经辽宁中医药大学王添敏教授鉴定为无患子科植物龙眼Dimocarpus longanLour.的假种皮。

1.3 试药

DNA 抽提试剂盒（批号：12888-100，Qiagen公司）；抗淀粉样前体蛋白（APP）抗体（批号：A16265）、抗BDNF抗体（批号：A11028）、抗TrkB抗体（批号：A12325）、抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（批号：3561122204）、辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔二抗（批号：AS014）均购于ABclonal 公司；抗磷酸化Tau（p-Tau，Ser396）抗体（批号：AF3148）、抗磷酸化TrkB（p-TrkB，Tyr515）抗体（批号：AF3462）均购于Affinity 公司；蛋白裂解液（批号：B0B800150）、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量测定试剂盒（批号：B27A001200）均购于沈阳鼎国生物科技有限公司；电化学发光（ECL）试剂盒（批号：P0018AFT，碧云天生物技术有限公司）。

1.4 仪器

NanoDrop2000 型微量紫外-可见分光光度计、Qubit 型荧光计均购于Thermo Fisher 公司；Miseq 型测序仪、Mi Seq 测序平台均购于Illumina 公司；580BR10905型聚合酶链式反应（PCR）仪（Bio-Rad公司）；2500型凝胶成像仪（Tanon公司）。

2 方法

2.1 龙眼肉水提取物的制备

参照本课题组前期方法[4]制备龙眼肉水提取物，取龙眼肉200.00 g，加10倍量双蒸水浸泡1 h后，加热使沸腾，保持沸腾状态继续煎煮1 h，滤过并收集滤液，提取3次，合并滤液，60 ℃减压浓缩至200 mL，冷冻干燥，-20 ℃保存。重复3次实验，计算提取率。

2.2 动物分组及给药

SPF级KM小鼠，随机分为对照组、模型组和龙眼肉组，每组10只。除对照组外，其余各组皮下注射D-半乳糖（140 mg·kg-1）及灌胃AlCl3（20 mg·kg-1），给药体积均为10 mL·kg-1，诱导建立小鼠AD模型[6]，每日1次，连续60 d；造模同时，龙眼肉组灌胃给予龙眼肉水提取物2.0 g·kg-1（生药量）[4]，给药体积10 mL·kg-1；对照组给予等量0.9%氯化钠溶液。

2.3 Morris水迷宫检测小鼠学习记忆能力

AD 造模55～60 d，进行Morris 水迷宫检测，实验共6 d，前5 d为定位航行实验，每天于4 个象限各训练1 次，每次60 s，以第5 天成绩作为定位航行实验结果；第6 天撤去水下平台，进行空间探索实验，以离平台最远象限作入水点。

2.4 16S-rDNA测序及生物信息学分析

Morris 水迷宫实验结束后，无菌收集各组小鼠粪便，每组收集1.0 g 左右，密封于无菌EP 管中，采用DNA 抽提试剂盒提取样本DNA，琼脂糖凝胶电泳及微量紫外-可见分光光度计检测DNA 纯度和浓度，以基因组DNA为模板，用带barcode 的特异引物进行PCR 扩增。委托上海欧易生物医学科技有限公司，对对照组、AD 模型组及龙眼肉组3 个组别共18 个样本进行16S-rDNA 测序。多样性鉴定区域为v3v4 区，引物序列为343F（5'-TACGGRAGGCAG CAG-3'）和798R（5'-AGGGTATCTAATCCT-3'）。扩增产物经电泳检测及磁珠纯化后再次PCR扩增，反复2 次，纯化后的PCR 产物进行Qubit 定量，根据PCR产物浓度进行等量混样，并上机测序，根据序列相似性，将相似度≥97%归为一个可操作单元（OTU），使用Qiime 1.8.0软件包挑选出各OTU的代表序列，并将所有代表序列与Silva 数据库进行比对注释，利用欧易生物云平台R包软件进行相关分析及绘图。

2.5 Western blot检测相关蛋白表达

各组取4 只小鼠海马组织，置于RIPA 裂解液中研磨，3000 r·min-1、4 ℃离心10 min（离心半径为14 cm），BCA 试剂盒测定蛋白浓度。等量的蛋白样品用8%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离、转膜，加一抗（抗APP、p-Tau、BDNF、TrkB 及p-TrkB 抗体，1∶1000 稀释）4 ℃孵育过夜，酶标二抗（1∶4000 稀释）室温孵育1 h，ECL显色，化学发光成像系统成像，Image J 1.53软件分析条带光密度值。

2.6 数据统计分析

采用GraphPad Prism 8.0.2统计软件进行数据分析，组间比较采用单因素方差分析和t检验，数据采用（±s）表示；16S 高维度数据，组间比较采用R语言相似性分析（Anosim）和多元方差分析（Adonis）；P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 龙眼肉水提取物的提取率及成分

龙眼肉水煎液冷冻干燥后称质量，计算提取率为49.27%±3.98%。根据前期研究结果，龙眼肉水提取物含有糖类、氨基酸、核苷酸等多种成分，糖类中以葡萄糖质量分数最高，为246.18 g·kg-1，占龙眼肉水提取物总质量的24.62%；并含有甘露糖等单糖成分、L-脯氨酸等氨基酸成分和尿苷等核苷酸成分[4]。

3.2 龙眼肉提高了AD小鼠学习记忆能力

Morris 水迷宫定位航行实验（图1A～图1C）中小鼠逃避潜伏期（第一次上台时间）和第一次上台前路程，模型组均较对照组延长（P＜0.001），龙眼肉组较模型组缩短（P＜0.001，P＜0.01）；各组小鼠第一次上台前平均速度，模型组较对照组慢但差异无统计学意义，龙眼肉组较模型组加快（P＜0.05）。空间探索实验（图1D～图1F）中小鼠穿越原平台次数、在原平台总停留时间和平台停留时间百分比，模型组均较对照组减少（P＜0.001），龙眼肉组均较模型组增加（P＜0.001）；另外，上述各检测结果，龙眼肉组与对照组差异均无统计学意义（图1）。结果表明，该造模条件下，模型小鼠出现了典型的学习记忆功能障碍，龙眼肉能提高小鼠学习记忆能力，并使之恢复至正常水平。

图1 龙眼肉对AD小鼠学习记忆能力的影响（±s,n=10）

3.3 龙眼肉改变了AD小鼠菌群多样性

3.3.1 OTUs分类分析 通过OTUs分类对不同来源的微生物群落样本进行分析，绘制花瓣图（图2A），结果可见，除去3组共有OUTs数191，模型组OUTs平均数目1711，较对照组（2139）明显减少（P＜0.01）；龙眼肉组OUTs 平均数目（1840）较模型组增加，但差异无统计学意义。对各分类层级（界、门、纲、目、科、属、种）上各样本的OTUs 数目和注释结果进行统计，结果表明，各组样本在不同分类水平下注释OTUs的总tags数目不同（图2B）。

图2 龙眼肉对AD小鼠OTUs分类水平的影响（±s,n=6）

3.3.2α多样性和β多样性分析α多样性分析反映生物环境内物种的多样性程度，常用物种累积曲线和等级聚类曲线等表示。由图3A可见，随着样本量增加，物种累积曲线趋于平缓，表明抽样充分；由图3B 可见，等级聚类曲线宽而平坦，说明物种组成丰富且均匀度良好。β多样性反应生境间的多样性程度，使用R软件绘制PCoA分析图，观察个体或群体间的差异，依据Bray Curtis 算法分析物种有无并进行Anosim 分析，结果表明，3 组间物种差异有统计学意义（图3C，P＜0.01），进一步基于Euclidean欧氏距离算法比较组间物种丰度差异，采用Adonis进行组间两两比较分析，发现组间物种丰度差异均有统计学意义（图3D～图3F，P＜0.01）。

3.3.3 菌群群落结构分析 以属水平为例，对群落结构做进一步分析，制作丰度前15（TOP15）菌群结构柱状图（图4A），选取差异物种丰度TOP10进行方差分析，制作相对丰度柱形图（图4B～图4K）。结果表明，与对照组比较，模型组拟普雷沃菌属、瘤胃球菌科_UCG-014 属、普雷沃氏菌科UCG-001、理研菌科RC9_gut属、瘤胃梭菌属和瘤胃球菌属_1丰度显著升高（P＜0.05），马文布赖恩特菌属丰度显著降低（P＜0.001）；经龙眼肉处理后，上述各种异常升高的菌属丰度均显著降低（P＜0.05），但对马文布赖恩特菌属，龙眼肉则无明显影响。另外，鼠杆菌属和毛螺菌科_UCG-001属，模型组与对照组差异无统计学意义，龙眼肉则使两者丰度显著提高（P＜0.01）。

图4 龙眼肉对AD小鼠群落结构的影响（±s,n=6）

3.4 龙眼肉影响了小鼠海马组织相关蛋白表达

与对照组相比，模型组APP 和p-Tau 蛋白表达显著提高（P＜0.05），龙眼肉2.0 g·kg-1（生药量）能显著降低模型组小鼠海马组织APP 及p-Tau 蛋白表达（P＜0.05）。模型组与对照组比较，BDNF、TrkB、p-TrkB蛋白及p-TrkB/TrkB蛋白表达均显著降低（P＜0.05），龙眼肉2.0 g·kg-1（生药量）提高了海马组织上述蛋白表达，其中对BDNF、p-TrkB 和p-TrkB/TrkB 蛋白表达影响差异有统计学意义（P＜0.05），对TrkB蛋白表达的影响无统计学意义（图5）。

图5 龙眼肉对AD小鼠海马组织相关蛋白表达的影响（±s,n=3）

4 讨论

APP 是一种广泛存在于多种组织的跨膜蛋白，可分解产生β淀粉样蛋白（Aβ）。大脑皮层及海马区出现Aβ沉积和Tau 蛋白过度磷酸化是AD 的典型病理特征。根据记忆力减退、Aβ沉积和Tau 过度磷酸化是AD 的典型特征，本研究首先采用Morris 水迷宫实验和蛋白免疫印迹实验对实验模型进行验证，并分析龙眼肉对类AD 小鼠的治疗作用，结果表明，实验成功建立了类AD 小鼠模型，并且该模型的病理特征可被龙眼肉逆转。进一步，笔者利用16SrDNA 测序技术进行小鼠粪便微生物多样性分析，结果提示龙眼肉可能通过调节菌群平衡干预AD。本研究D-半乳糖/AlCl3诱导的AD 小鼠模型瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）_UCG-014 丰度升高与AD 患者菌群变化一致[7]；龙眼肉组瘤胃球菌属（Ruminococcus）_1 及毛螺菌科（Lachnospiraceae）_UCG-001 属丰度升高亦与文献APP/PS1 小鼠治疗后肠道微生物变化结果相符[7]。瘤胃球菌科、瘤胃球菌属和毛螺菌科_UCG-001均归属厚壁菌门，厚壁菌门是体内丁酸的主要生产者[8]。本研究结果提示龙眼肉可能是通过影响厚壁菌门，改变其代谢产物短链脂肪酸水平进而产生中枢作用。

BDNF 是在脑内合成的一种神经营养因子，在神经元的存活、分化及生长发育中起着重要作用，影响情感和认知功能[9]。在AD 发生早期，AD 患者就已经检测出脑组织中BDNF 表达下降[10]。TrkB 是BDNF 的特异性受体，BDNF 与TrkB 结合后，引起TrkB 自身磷酸化增加，进而促进神经元生长、生存和分化[11]。肠道菌群与AD等中枢神经退行性疾病相关，与脑-肠轴相互作用、相互影响[12]。据报道，肠道菌群紊乱会减少大脑皮质及海马中的BDNF表达，从而导致中枢神经系统功能失调，引起行为异常和认知障碍乃至AD的发生[13]。基于肠道菌群与脾的异曲同工作用，以及其与BDNF 的密切相关性，本研究在龙眼肉抑制小鼠脾虚痴呆[4]的前期研究基础上，探讨了龙眼肉调节肠道菌群和BDNF-TrkB 通路抗AD 的作用机制。Western blot 实验结果表明，龙眼肉显著提高了BDNF-TrkB 通路关键蛋白BDNF 和p-TrkB 蛋白表达，提高了p-TrkB/TrkB 蛋白表达的比值。综合本研究结果，笔者认为龙眼肉能够明显抑制D-半乳糖/AlC3诱导的类AD 小鼠病理进程，调节肠道菌群、激活BDNF-TrkB 信号通路是龙眼肉抗AD的可能机制。

[利益冲突]本文不存在任何利益冲突。