基于ITS条形码的滇鸡血藤及混伪品分子鉴定△

刘心雨，姜丹，杨楚楚，徐庆一，徐裕彬，陈绪军，任广喜*，刘春生*

1.北京中医药大学 中药学院，北京 102488；

2.北京橘井健康科技集团有限公司，北京 100068；

3.北京卫仁中药饮片厂有限公司，北京 101300

滇鸡血藤作为临床常用的中药，为木兰科南五味子属植物内南五味子Kadsura interiorA.C.Smith的干燥藤茎，主产于云南西南部的保山、凤庆、临沧、耿马等地。滇鸡血藤味苦、甘，性温，归肝、肾经，具有活血补血、调经止痛、舒筋通络的作用，主要用于月经不调、痛经、麻木瘫痪、风湿痹痛、气血虚弱等症[1]。滇鸡血藤在妇科用药中较为常见，特别在云南地区，滇鸡血藤常被熬制成滇鸡血藤单膏，或与川牛膝、续断、红花、黑豆一起组成复方滇鸡血藤膏[2]，使用较为广泛。滇鸡血藤药材的混伪品较多，目前基原植物的界定存在着较大争议，影响了临床用药的安全性和有效性。前期系统分类学研究发现，内南五味子与异形南五味子K.heteroclita（Roxb.）Craib、南五味子K.longipedunculataFinet &Gagnep.、黑老虎K.coccinea（Lem.）A.C.Smith 的亲缘关系较近，属于近缘物种，且后三者均具有一定的药用价值，药材的外观特征与内南五味子相似，在实际应用过程中很容易混淆[3-4]。徐菁[5]从化学成分和药效活性2 个角度出发对内南五味子及其近缘种进行差异比较，挖掘内南五味子止痛活性的特征标志物，阐明了内南五味子与近缘种的差异性。但化学成分含量受采收时间等诸多因素的影响，通过规定合理的数值标准进行药材鉴别存在较大困难。另有研究从植物形态、药材性状、显微特征等方面对比了滇鸡血藤基原植物内南五味子与异形南五味子之间的差异，结果显示二者的差异主要体现在雄蕊的花丝与药隔连成的形状、药室与雄蕊的长短比例等方面，在药材栓皮裂隙及石细胞形态上虽有一定差异但不明显[6-7]。在实际生产中，从产地收购的中药材往往经过一定的加工处理，流通到市场的中药材难以保持植物的原形态，同时，滇鸡血藤以茎入药，通过植物形态进行区分鉴定较为困难。性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别等传统的鉴别方法存在一定的局限性和主观性[8]。以DNA 作为遗传标记的中药鉴定差异信息量大、稳定性高。为保证滇鸡血藤药材基原植物的准确性，亟待从分子生物学方面对滇鸡血藤药材基原植物内南五味子及其近缘物种展开差异性研究。

目前，DNA 条形码技术已被广泛应用到动植物药材[9-18]及真菌细菌[19-21]等微生物的鉴定中，同时，随着近些年来该技术的飞速发展，在中成药[22-24]及中药配方颗粒[25-26]等深加工产品领域的鉴定也取得了显著成效。植物类药材鉴定的通用候选序列有rbcL、matK、psbA-trnH、内转录间隔区（ITS）和ITS2等[27-30]。尚飞能等[31]基于ITS2条形码及化学指纹图谱建立了何首乌及其伪品的鉴定方法。王俊等[32]通过对7 条候选条形码ITS、ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK、trnL（UAA）内含子、trnL（UAA）的筛选，将trnL（UAA）内含子序列作为血竭药材的DNA 条形码鉴定序列。在滇鸡血藤的分子鉴定中，熊瑶等[33]研究发现，matK不能把滇鸡血藤和南五味子分开。周红等[34]研究表明，采用psbA条形码对鸡血藤、滇鸡血藤、大血藤药材进行分子鉴定构建发育树时，鸡血藤、大血藤均单独聚为一支，能明显地与其他混伪品区分开，但滇鸡血藤与异形南五味子聚为一支，无法区分。ITS 序列是核糖体基因非转录区的一部分，具有长度保守性、序列变异性高、进化速度快等优点，在药用植物及其混伪品鉴定上具有良好的重复性和稳定性[35]，故采用ITS条形码鉴定滇鸡血藤及其混伪品具有可行性。

单核苷酸多态性（SNP）主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA 序列多态性。由多个SNP 突变构成的一种突变谱被称为一种单倍型。郑司浩等[36]基于甘草基因组的SNP 分子标记可成功鉴定不同产地的甘草。刘佳[37]通过对大黄matK序列差异位点分析，将其划成了不同的单倍型，其中以掌叶大黄和唐古特大黄的单倍型种类最多，同时还发现不同产地所包含大黄单倍型的种类和数量也存在一定的差异。朱兰等[38]根据云上黑山羊3 个核心群的SNP 位点对其进行了遗传多样性及遗传关系的研究分析。本研究基于滇鸡血藤ITS 条形码的SNP 位点，构建滇鸡血藤单倍型数据库，区分鉴定鸡血藤及其混伪品，同时为滇鸡血藤种内遗传多样性研究提供参考。

1 材料

1.1 样品

共收集滇鸡血藤及混伪品药材165 份，其中包括滇鸡血藤药材145份、南五味子药材8份、异形南五味子（药材粉末）5 份、黑老虎（叶片）7 份，滇鸡血藤样品主要来源于云南凤庆等地，由河北橘井药业公司提供。以上所有样品经北京中医药大学刘春生教授鉴定，具体信息见表1。

表1 滇鸡血藤及混伪品样品信息

1.2 仪器与试剂

LSB35 型立式压力蒸汽灭菌器（江阴滨江医疗设备有限公司）；MM400 型球磨仪（德国Retsch 公司）；1-14 型台式小型离心机（德国Sigma 公司）；eriti 96 型梯度聚合酶链式反应（PCR）扩增仪（美国ABI公司）；JY-SP3型水平电泳槽（北京君意东方电泳设备有限公司）；GelDoc2000 型凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）。

植物基因组DNA 提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；2×RapidTaqMaster Mix 酶和DL2000 Plus Marker（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；ITS 引 物（ITS-1F：5ʹ-TCCGTAGGTGAACCTGC GG-3ʹ，ITS-4R：5ʹ-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3ʹ）由北京睿博兴科生物技术有限公司合成；琼脂糖、50×TAE 溶液均购于北京兰博利德生物技术有限公司。

2 方法

2.1 基因组总DNA提取

滇鸡血藤药材用75%乙醇擦洗表面后晾干；用75%乙醇擦过的剪刀将样品剪碎，称取药材约70 mg（按照DNA 提取试剂盒要求的取样量为干燥组织30 mg，但由于滇鸡血藤药材质地坚硬、纤维性强，研磨时较为困难，故应加大取样量至70～100 mg，对于研磨不充分的样品应进行二次研磨），放入已灭菌的离心管中，同时每个离心管里放入已灭菌的小钢球2个；将离心管放入液氮中快速冷冻样品，冷冻好的样品用球磨仪研磨5 min（30 r·s-1），编号备用。处理好的药材粉末用植物基因组DNA 提取试剂盒提取总DNA，65 ℃水浴1 h，期间摇晃数次混匀，其余步骤按照试剂盒说明书进行；所得DNA 于-20 ℃冰箱中保存备用。

2.2 PCR扩增及测序

ITS引物用灭菌双蒸水溶解并稀释至100 μmol·L-1。PCR 反应体积为30 μL，含2×RapidTaqMaster Mix 15 μL、正反引物各1 μL（100 μmol L-1）、ddH2O 11 μL、总DNA 2 μL。PCR 反应程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，56.4 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s（35 个循环）；72 ℃ 5 min。

采用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物，电压130 V，电泳时间20 min；凝胶成像系统检测，将单一、明亮的扩增条带送至上海生工生物工程有限公司进行双向测序。

2.3 测序分析及数据处理

测序原始结果利用CExpress v3.0.0 软件进行序列拼接，并根据测序峰图对碱基进行校正，去除引物区及两端低质量序列；将得到的所有序列分别在美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库中进行Blast（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比对，在从多方面确认参考序列准确性的基础上，查看2 条序列的一致性，并对差异较大的序列进行判断分析；使用DNAMAN v6 软件进行多序列比对，统计其片段长度及变异位点个数；使用MEGA 5.0软件计算K2P 遗传距离，并且使用邻接法（NJ）构建系统进化树，聚类分析使用Bootstrap 进行分析，通过进行1000 次自展重复分析获得。当同一物种的所有个体在系统树上聚为一个单系，且支持率高于50%，则视为该物种鉴定成功；同时，根据滇鸡血藤ITS 条形码的SNP 位点构建滇鸡血藤单倍型数据库，确定滇鸡血藤单倍型数据库所包含的单倍型数量。

3 结果

3.1 种内种间遗传距离分析

使用MEGA 软件计算ITS 序列的种内、种间遗传距离，基于K2P遗传距离模型计算样品平均种间、种内遗传距离。滇鸡血藤种内平均遗传距离为0.002，滇鸡血藤与异形南五味子、南五味子、黑老虎的种间平均遗传距离为0.011。统计分析样品种间及种内遗传距离，得出遗传距离分布表（表2）。理想DNA 条形码种内遗传距离应明显小于种间距离，两者之间存在明显的界限。滇鸡血藤及其混伪品ITS 条形码序列虽具有较小的种内变异和较大的种间变异，但种内种间遗传距离存在着部分重叠，barcoding gap较不明显。

表2 滇鸡血藤与其混伪品ITS条形码种间与种内遗传距离分布占比 %

3.2 系统发育树聚类分析

使用MEGA 软件分别对145 份滇鸡血藤及其混伪品、滇鸡血藤19 种单倍型及混伪品构建系统发育树。基于ITS 条形码构建的系统发育树中共包括滇鸡血藤145 份、异形南五味子1 份（4 份异形南五味子粉末微生物污染，测序分析失败）、南五味子8份、黑老虎7 份。滇鸡血藤、黑老虎各单独聚为一支，异形南五味子与南五味子聚为一支，滇鸡血藤能够与其他3 个物种明显分开，见图1。滇鸡血藤ITS 序列的19 种单倍型（DBX1～DBX19）与伪品构建系统发育树，与上述结果保持一致，滇鸡血藤单独聚为一支，见图2。由此可知，ITS 可以作为鉴定滇鸡血藤及混伪品的DNA条形码。

图1 滇鸡血藤及其混伪品ITS条形码系统发育树

图2 滇鸡血藤19种单倍型及其混伪品ITS条形码系统发育树

3.3 滇鸡血藤ITS单倍型数据库的分析

使用ITS通用引物对前期收集的110份滇鸡血藤样品（KI1～KI110）进行PCR 扩增，均获得单一、明亮的条带。PCR 扩增率和测序成功率均为100%，样品胶图见图3。使用DNAMAN 软件进行多序列比对，序列长度为675 bp，有9 个变异位点，共包括19 种单倍型，序列相似度99.52%，鸟嘌呤+胞嘧啶（G+C）占比为55.42%～55.87%。其中，滇鸡血藤在163、647 bp 存在C-胸腺嘧啶（T）杂交（用字母N 表示），具体单倍型信息见表3。在110 份滇鸡血藤样品中，单倍型1 共1 份，为样品KI80；单倍型2共1 份，为样品KI40；单倍型3 共1 份，为样品KI43；单倍型4 共1 份，为样品KI67；单倍型5 共2份，为样品KI77、KI108；单倍型6 共2 份，为样品KI85、KI87；单倍型7 共2 份，为样品KI41、KI84；单倍型8 共1 份，为样品KI79；单倍型9 共2 份，为样品KI19、KI60；单倍型10 共1 份，为样品KI88；单倍型11 共1 份，为样品KI92；单倍型12 共34 份，包括样品KI1、KI3、KI4 等；单倍型13 共4 份，为样品KI21、KI36、KI39、KI70；单倍型14 共35 份，包括样品KI2、KI6、KI8 等；单倍型15 共5 份，为样品KI10、KI27、KI30、KI59、KI76；单倍型16共2 份，为样品KI78、KI90；单倍型17 共4 份，为样品KI5、KI18、KI42、KI66；单倍型18 共10 份，包括样品KI28、KI31、KI33 等；单倍型19 共1 份，为样品KI103。其中，以单倍型12、14 的样品数量居多，单倍型15、18次之。

表3 滇鸡血藤ITS条形码19种单倍型变异位点

为验证所建滇鸡血藤单倍型数据库的稳定性，后期于市场采购35份滇鸡血藤样品（KI111～KI145），采用ITS 通用引物扩增，所得序列与所建滇鸡血藤数据库保持一致，未出现新的单倍型，样品胶图见图4。在35 份滇鸡血藤样品中，包括单倍型5 共2份、单倍型7 共4 份、单倍型9 共1 份、单倍型12 共6 份、单倍型14 共16 份、单倍型15 共5 份、单倍型18 共1 份。对145 份滇鸡血藤ITS 单倍型种类及数量进行汇总，单倍型1～19（药材份数分别为1、1、1、1、4、2、6、1、3、1、1、40、4、51、10、2、4、11、1）分别占总数的0.69%、0.69%、0.69%、0.69%、2.76%、1.38%、4.14%、0.69%、2.07%、0.69%、0.69%、27.59%、2.76%、35.17%、6.90%、1.38%、2.76%、7.59%、0.69%。综上所述，单倍型12、14为滇鸡血藤ITS条形码中的主要单倍型种类。

图4 滇鸡血藤样品KI111～KI145电泳图

4 讨论

滇鸡血藤作为目前临床常用的一种补血活血、调经止痛的大宗药材，已在我国历史上沿用千年。由于植物形态相似，《Flora of China》将内南五味子归并为异形南五味子[3-4]，但前期相关研究表明内南五味子与异形南五味子在植物形态、化学成分和药效活性方面都有显著差异[5-7]，目前滇鸡血藤基原植物的界定还存在着较大争议。随着药用资源的日益紧缺，市场需求量的逐渐增大，出现了不同程度的药材掺伪现象，特别是近缘物种之间的以假乱真，造成中药材市场的产品质量参差不齐，这严重影响了临床用药的安全性和有效性。ITS 作为核基因条形码，也存在鉴定不理想或失败的情况，如PCR 扩增结果易受到真菌等微生物的干扰作用[39]。前期滇鸡血藤种内种间遗传距离的计算及所构建的系统发育树结果显示，滇鸡血藤种内种间遗传距离存在着部分重叠现象，虽然系统发育树上显示滇鸡血藤单独聚为一支，但是据此得出ITS 可以作为鉴别滇鸡血藤及其混伪品的DNA 条形码缺乏一定的科学性。通过建立滇鸡血藤ITS 单倍型数据库，对结果进行了补充验证，证明了滇鸡血藤与其混伪品之间存在分子水平的差异，不仅为滇鸡血藤临床用药的安全性和准确性提供了保障，同时也能丰富滇鸡血藤的基因数据库，使滇鸡血藤种内变异得到较为全面、科学的解释。单倍型是单倍体基因型的简称，在遗传学上是指在同一染色体上进行共同遗传的多个基因座上等位基因的组合，即若干个决定同一性状的紧密连锁的基因构成的基因型。Dong 等[40]基于SNP位点的简化基因组测序（RAD-seq）对内南五味子及其异形南五味子等4 个近缘种进行基因多样性、系统发育重建和群体遗传结构分析，揭示了物种之间存在基因交流及生态位分化。谢平等[41]通过分析平贝母ITS 和matK序列中所包含的单倍型种类及数量，为贝母属植物的物种界定提供了较为有效的理论依据。为了充分利用DNA 条形码大批量、快速、准确地鉴定物种的优势，除确立用于鉴定该物种及其常见混伪品的标准条形码外，以此为基础构建该物种的单倍型数据库也显得至关重要。

本研究一方面通过计算种内、种间遗传距离，构建系统发育树比较了滇鸡血藤及其混伪品的亲缘关系，初步确定了ITS 可以作为滇鸡血藤及其混伪品的鉴定条形码；另一方面通过建立滇鸡血藤ITS单倍型数据库对上述结论进行辅证，实现滇鸡血藤的真伪鉴别，同时也为滇鸡血藤的物种界定提供了参考。

[利益冲突]本文不存在任何利益冲突。