慢性萎缩性胃炎及癌前病变复合造模法评价

刘雨溪,王 璐,龙凯花,刘 洋,靳景瑞,张 红,(陕西省中医药研究院中药研究所,西安 7000;陕西中医药大学药学院;中国医科大学临床二系;通讯作者,E-mail:zhanghong9999@6.com)

慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)是一种消化系统常见疾病,其特征是胃黏膜因溃疡、糜烂和慢性炎症而失去正常的腺上皮,导致黏膜损伤和功能障碍[1]。在临床上,CAG患者常表现为上腹部隐痛、胀满、嗳气和食欲不振等消化系统症状。此外,一些患者还会出现胃食管反流和胆汁反流等问题,这些问题对生活质量产生了严重的影响[2]。1975年,Correa[3]提出了一个渐进演变模式:正常胃黏膜—浅表性胃炎—萎缩性胃炎—肠上皮化生—异型增生—胃癌。而后1978年世界卫生组织将CAG列入癌前状态,受到了医学界的普遍重视[4]。胃癌是一种常见的恶性肿瘤,胃癌位居2022年中国癌症发病率和死亡率的前三位,并且发病率均位居世界前列,造成沉重的疾病负担[5]。目前胃癌尚无满意的治疗方法且发病机制不完全清楚,但众所周知,CAG是胃癌发生发展的主要因素之一[6]。因此,成功治疗CAG可能有助于预防胃癌的发生。若能逆转CAG,则可成为防治胃癌前病变(precancerous lesions,PLGC)及降低胃癌发生率的重要措施。为了实现对CAG及胃癌的逆转和预防,需要建立动物模型并进行实验研究以深入探究其发病机制和治疗方法。目前对CAG或PLGC动物模型的建立包括单化学因素或多化学因素造模法、物理刺激法、免疫造模法、幽门螺杆菌感染法、手术造模法以及中医证候模型复制法[7]。无论采用何种方法,结果都与理想的动物模型存在一定程度的差异。由于对于药物作用时间、剂量、成模稳定性等方面在建模期间缺乏统一的标准。因此找到稳定、可靠的动物模型复制方法成为临床研究的重要基础。N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)是最公认的CAG造模试剂之一,具有致癌性;脱氧胆酸钠可中和胃酸,造成胃黏膜病变且模拟胆汁反流对胃黏膜的侵害;水杨酸钠属于非甾体抗炎药,可释放大量促炎因子从而加速黏膜炎症;饮食不规律会造成胃酸分泌紊乱,从而对胃黏膜产生刺激,进而引发胃炎[8-10]。人体是复杂机体,病变发作往往非单一因素所致,故常采取多化学因素联合的方式进行造模,多因素模型相对稳定可靠,可缩短造模时间,提高成模率[11]。目前虽然已有多因素造模法,但其造模效率和可复制性仍需提高[12,13]。本研究采用MNNG联合脱氧胆酸钠、水杨酸钠和不定期禁食的4种因素综合造模方法构建CAG及PLGC动物模型,以期为后续CAG及PLGC药物开发提供符合临床特点的动物模型。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 60只2月龄雄性SPF级SD大鼠购自西安交通大学实验动物中心[生产许可证:SCXK(陕)2020-005],所有实验在陕西省中医药研究院伦理委员会许可下进行[(2023)动物伦审第(10)号]。实验按照3R原则进行。

1.1.2 试剂 MNNG、水杨酸钠及脱氧胆酸钠均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 将大鼠按照体质量随机分为对照组(n=10)和模型组(n=50)。对照组正常喂养,模型组采用MNNG(200 μg/mL)自由饮用+2%(m/V)水杨酸钠隔日灌胃+脱氧胆酸钠(20 mmol/L)隔日灌胃复合造模法,每周间隔禁食3 d,造模6个月。

1.2.2 检测指标与方法 每日观察大鼠状态,包括毛发、粪便及活动,并监测大鼠体质量。于造模第3,4,5个月分别通过过量CO2吸入法处死送病理学诊断大鼠各3只,第6个月处死10只,处死大鼠后取胃组织进行HE染色,观察病理变化。于造模结束后采用混合纯氧进行麻醉,通过氧气气流使异氟烷挥发,异氟烷浓度2%～3%,麻醉5 min。通过眼眶取血采对照组和模型组大鼠血液,采用ELISA法检测每只大鼠血清中胃蛋白酶原Ⅰ(PG Ⅰ)、胃蛋白酶原Ⅱ(PG Ⅱ)及胃泌素17(G-17)含量。

1.3 统计学方法

采用Graphpad Prism 8.0软件进行统计分析。两组动物生存曲线采用Kaplan-Meier法进行统计。两组PG Ⅰ、PG Ⅰ与PG Ⅱ比值(PG R)、G-17数据经检验符合正态分布且方差齐,使用独立样本t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠临床体征

对照组大鼠体形肥胖,毛色光亮,反应灵敏,饮食、饮水量正常,大便成形,视力正常。模型组大鼠自第3个月开始体形均明显较对照组瘦小,皮毛发黄,喜蜷卧扎堆,反应迟钝,部分大鼠大便质稀、视力不佳。

2.2 各组大鼠死亡情况

模型组大鼠于第3个月开始出现死亡,至第6个月模型成功。除第3,4,5个月分别常规处死送病理学诊断大鼠各3只,及第6个月处死10只外,异常死亡6只,死亡率12%,异常死亡大鼠经解剖发现5只出现严重胃肠胀气,1只为灌胃呛咳窒息。对照组大鼠无死亡。造模过程中,大鼠生存曲线见图1。

图1 对照组和模型组造模过程中大鼠生存曲线Figure 1 Survival rate of control and model rats during the modeling

2.3 各组大鼠体质量比较

与对照组相比,模型组大鼠于第1个月开始明显降低(P<0.05);第2～6个月模型组大鼠体质量较稳定,有轻微下降趋势,对照组大鼠体质量随时间稳步增长(见图2)。

注:与同时点对照组比较,**P<0.05。图2 对照组和模型组造模过程中大鼠体质量变化Figure 2 Changes of body weight during the modeling in control group and model group

2.4 各组大鼠胃黏膜病理组织学比较

HE染色结果显示:对照组大鼠胃组织黏膜无异常,胃腺细胞形态结构正常,未见炎症(见图3A);大鼠造模3个月,胃组织黏膜层可见少量上皮细胞与较多胃腺细胞脱落,固有层可见多处轻度出血,局部可见少量胃腺细胞坏死,黏膜下层可见水肿,结缔组织排列疏松(见图3B);大鼠造模4个月,大量胃腺细胞坏死脱落,核固缩深染或碎裂,黏膜腺体减少,有明显间质纤维增生(见图3C);大鼠造模5个月,胃黏膜层变薄,黏膜腺体减少,间质纤维增生并伴随少量炎细胞浸润(见图3D);大鼠造模6个月,可见慢性萎缩性胃炎的典型病理特征,胃组织可见大量胃腺扩张,小面积溃疡,多量黏膜上皮细胞坏死脱落,固有层胃腺坏死,结构消失,结缔组织增生,伴少量淋巴细胞浸润,多量胃腺腔内可见少量粒细胞,大面积黏膜层与肌层分离(见图3E)。造模6个月,部分大鼠胃部形成隆起型肿瘤,呈不规则状,血管丰富;组织可见广泛性全层坏死,黏膜上皮及大量胃腺结构消失,伴有较多的粒细胞、淋巴细胞及巨噬细胞浸润,结缔组织增生修复,腔内多见坏死细胞碎片,肿瘤细胞浸润至固有层,此为胃癌的病理特征(见图3F)。

注:A.对照组;B.模型组3个月;C.模型组4个月;D.模型组5个月;E.模型组6个月出现胃黏膜萎缩;F.模型组6个月出现胃癌。图3 大鼠胃黏膜病理变化Figure 3 Pathological changes of gastric mucosa in rats

造模结束后,对照组大鼠胃组织无病变,模型组10只大鼠全部出现胃黏膜萎缩,4只出现不同程度的异型,2只出现肠上皮化生,1只出现胃癌(见表1,2)。

表1 各组大鼠造模6个月后胃黏膜病理改变 例(%)Table 1 Pathological changes of gastric mucosa in rats in each group after 6-month modeling cases(%)

表2 各组大鼠造模6个月后胃黏膜病变程度比较 例(%)Table 2 Comparison of the degree of gastric mucosal lesion of rats between two groups after 6-month modeling cases(%)

2.5 各组大鼠血清PG Ⅰ、PG R、G-17比较

造模结束后采集大鼠血清,检测结果显示,与对照组比较,模型组PG Ⅰ升高,PG R降低,G-17降低(均P<0.05,见图4)。PG Ⅰ偏高代表胃酸分泌增加,PG R降低与腺体萎缩、上皮化生及异型增生相关,G-17偏低提示可能出现胃黏膜萎缩、胃溃疡或胃癌等器质性胃部疾病。以上结果均能证明模型组大鼠已出现CAG相关症状。

注:与对照组比较,**P<0.05。图4 对照组和模型组大鼠血清PG Ⅰ、PG R、G-17比较Figure 4 Comparison of PG Ⅰ, PG R, and G-17 in rat serum between control group and model group

3 讨论

本研究采用复合造模法成功构建了大鼠CAG癌前病变模型。随着对CAG的发病机制及治疗药物研究的深入,出现多种多样的动物实验造模方法。目前,常用造模方法包括化学造模法、物理刺激法、免疫造模法、幽门螺杆菌感染法、手术造模法以及中医证候模型复制法等。其中化学造模法虽然实验周期较长、操作次数多,但成模率相对较高、稳定性好、操作也较为简单。但运用化学法造模时,若只使用单因素,成功率低,因此,复合造模法应用更为广泛。

在复合造模法中,MNNG起主要作用,MNNG作为一种化学诱癌剂,主要模拟不当摄入硝酸盐后在胃内转化为亚硝酸胺等致癌物质,从而导致CAG、PLGC甚至胃癌的发生。CAG造模的研究中,MNNG自由饮用或定量灌胃法均有使用。有研究观察了不同给药剂量及给药途径的MNNG对大鼠胃黏膜组织病理学的影响,发现MNNG自由饮用联合灌胃、雷尼替丁饲料、饥饱失常、烫热高盐饮食能成功诱导大鼠PLGC模型;但大剂量MNNG灌胃使PLGC诱变率降低,死亡率上升,并出现明显前胃鳞状上皮病变[12]。因此本研究在既往研究的基础上进行优化,采用MNNG自由饮用法,联合其他因素进行造模,从而提高造模的成功率和稳定性,并降低死亡率。

MNNG不依赖于酶的代谢作用,而是直接作用于胃黏膜上皮,使原有DNA链上的碱基发生突变,诱导胃炎、癌前病变或胃癌的发生。大鼠的胃、肝、肾都有将MNNG转化为MNG从而导致MNNG失活的能力,但胃的转化能力最差,并且MNNG更易渗透胃幽门部和胃底部黏膜,所以通常选用MNNG诱导CAG或PLGC[13]。但人类CAG和PLGC通常是多因素共同作用的结果,目前也普遍认为联合应用一些刺激因素造成胃黏膜非特异性损伤可提高CAG及PLGC的诱发率。饮食不规律会造成胃酸分泌紊乱,从而对胃黏膜产生刺激,进而引发胃炎;脱氧胆酸钠可诱导胆汁酸代谢紊乱和胃部菌群失调,造成胃黏膜病变且模拟胆汁反流对胃黏膜的侵害;水杨酸钠对胃黏膜的损伤表现在对局部的直接刺激作用引起胃黏膜炎性反应,胃黏膜细胞剥脱,并抑制胃黏膜的生长。本研究使用的MNNG+水杨酸钠+脱氧胆酸钠配合不定期禁食的复合造模法,相比其他以MNNG为主的造模方法[12,13],动物死亡率更低,稳定性更高,能够成功且稳定地构建CAG及PLGC模型,但由于动物个体差异,造模进程难以完全统一,检测标准以PG Ⅰ、PG R、G-17及病理切片结果为主,所以CAG和PLGC模型之间的差异难以明确鉴别。造模6个月发现有个别大鼠已出现癌变,这也提示该造模方法能够造成胃癌模型,但造模成功率及稳定性有待进一步验证。

CAG是临床常见慢性病,然而目前针对CAG的治疗方法都不尽如人意,新型有效的治疗方案亟待开发。构建成熟可复制的CAG动物模型,并从细胞和分子层面了解CAG病变的发病机制及演变过程,为研发防治CAG药物提供基础。本研究提供了一种行之有效的CAG大鼠造模方法,未来将在此方法的基础上继续完善,希望找到更加高效的造模方法,并能找到CAG与PLGC模型间的差别,为制定成功率高且简单易行的造模方法提供参考,为后续CAG及PLGC药物开发提供符合临床特点的动物模型。