新疆维吾尔自治区阿克苏地区牛羊体表蜱携带斑点热群立克次体调查

马爱军，李 佳，金 敏，金依璇，刘诗语，刘凯强，刘 燕，甘 露，巴音查汗·盖力克

（1.新疆农业大学动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2.新疆维吾尔自治区阿克苏地区动物疫病控制诊断中心，新疆阿克苏 843000）

蜱是专性吸血体外寄生虫， 寄生在宿主体表期间，以吸食宿主血液为生，同时会将携带的病原传播给宿主，可导致宿主出现发热、组织损伤、身体麻痹、贫血等症状［1］。 据《动物寄生虫病学》［2］记载，蜱可携带83 种病毒、14 种细菌、18 种螺旋体、32 种原虫、1 种衣原体、1 种支原体、1 种巴尔通体和2 种线虫。在我国，已报道的蜱携带的病原体包括真菌、病毒、立克次体、螺旋体和寄生虫，能传播的重大疫病有蜱传回归热、立克次体病、新型布尼亚病毒感染引起的发热伴血小板减少综合征、莱姆病、森林脑炎、克里米亚-刚果出血热和Q 热［3-7］。

立克次体属 （Rickettsia） 隶属于变形菌门（Proteobacteria），α-变形杆菌纲（Alphaproteobacteria）， 立克次体目 （Rickettsiales）， 立克次体科（Rickettsiaceae）［8］。立克次体是一种细胞内专性革兰阴性菌， 可以寄生于哺乳动物和节肢动物 （如蜱、螨、蚤和虱）体内［9］。 目前，立克次体属相对被认可的分类为以下4 个群：斑点热群（spotted fever group Rickettsia，SFGR）、 斑 疹 伤 寒 群（typhus group，TG）、 贝 氏 立 克 次 体 群 （Rickettsia bellii group）和加拿大立克次体群（Rickettsia canadensis group）［1］。蜱传立克次体病主要由属于立克次体属斑点热群的专性胞内细菌引起［1］。 由于症状的非特异性，立克次体感染难以诊断。 同时，该病常呈无症状感染，因此，感染情况容易被低估，造成其广泛流行。

目前， 在新疆维吾尔自治区已有节肢动物携带多种立克次体的报道，如：从伊犁哈萨克自治州边境地区的图兰扇头蜱中首次检测到埃氏立克次体、马赛立克次体、康氏立克次体印度亚种和暂定巴布瑞立克次体［10］；在民丰县采集的花蠕形蚤中检测到斑点热群立克次体［11］，这也是在世界上首次证实蚤类可携带立克次体； 在艾丁湖的短垫血蜱中首次检测到饶氏立克次体［12］。 阿克苏地区地处南疆腹地，地理、气候条件多样，蜱种类丰富，为了解该地区蜱携带立克次体情况， 本研究在阿克苏地区采集牛羊体表蜱并开展立克次体流行病学调查， 以期为该地区蜱及蜱传疾病的科学防控提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源

2023 年4—6 月， 在新疆维吾尔自治区阿克苏地区牛羊体表采集蜱574 只， 其中， 阿克苏市344 只、 温宿县93 只、 沙雅县98 只， 乌什县39只。每只蜱单独分装于含有70%乙醇的1.5 mL EP管中，存放于4 ℃冰箱保存待检。

1.1.2 主要试剂

DNA 提取试剂盒、DNA 凝胶回收试剂盒、GoldenViewTM核酸染料， 购自江苏康为世纪生物科技有限公司； 大肠杆菌DH5α 感受态细胞、PMD19-T 载体、Solution I， 购自宝日医生物技术（北京）有限公司；DL 2 000 DNA Marker、琼脂糖、10%NaOH 溶液、1×PBS 溶液， 购自北京鼎国生物技术有限公司。

1.1.3 主要仪器

Gel Doc+型SDS-PAGE 凝胶成像系统、S1000型PCR 仪，购自美国Bio-Rad 公司；SPX-70 型恒温培养箱，购自中仪国科（北京）科技有限公司；TG16D 型离心机， 购自上海生物科技有限责任公司；HH-W420 型电热恒温水浴锅、SHA-CAB 型数显冷冻水浴恒温振荡器， 购自常州荣华仪器制造有限公司；可调节微量移液枪，购自德国艾本德股份公司。

1.2 试验方法

1.2.1 蜱基因组DNA 提取

先将蜱分别用70%酒精、1×PBS 溶液振荡清洗3 次，平放于滤纸上晾干后装入研磨袋中，在研钵中加入液氮将其磨碎， 然后加入200 μL 1×PBS溶液吹打混匀转入EP 管中。离心弃上清液后加入20 μL 蛋白酶K，56 ℃水浴3～4 h 至蜱完全溶解。随后按照DNA 提取试剂盒说明书提取蜱基因组DNA。

1.2.2 立克次体分子生物学鉴定

以郭丽萍［10］报道的立克次体外膜蛋白B 基因（ompB）引物序列和周鹏［13］报道的立克次体细胞表面抗原1 基因（sca1）引物序列（见表1），采用PCR 法对立克次体进行分子生物学鉴定。 PCR 反应体系（25 μL）包括：Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。 ompB 基因和sca1 基因的PCR 扩增条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循环次数30 次；72 ℃最后延伸1 min。 阳性对照为阿克苏地区动物疫病控制诊断中心保存的经测序确定的阳性DNA，阴性对照为ddH2O。所有引物合成与基因测序均由北京新时代众合科技生物公司完成。

表1 立克次体分子生物学鉴定所用引物信息

1.2.3 目的片段连接、转化及测序

对ompB 基因和sca1 基因进行PCR 扩增后，将与预期片段大小一致的阳性条带，按照DNA 凝胶回收试剂盒说明书进行回收。 胶回收产物与PMD19-T 载体连接，连接体系为：胶回收产物5 μL，SolutionI 1 μL，PMD19-T 载体1 μL。 16 ℃水浴30 min， 然后将连接产物加入50 μL 大肠杆菌DH5α 感受态细胞，冰浴30 min，热激45 s，冰浴2 min，加入800 μL 新鲜无抗性的LB 液体培养基混匀。37 ℃培养箱摇菌1 h，5 000 r/min 离心3 min后弃去700 μL 上清液， 剩余150 μL 上清液重悬菌体，在含氨苄西林抗性的平板上涂板。将平皿放入37 ℃培养箱，先正置培养30 min，后倒置培养8～10 h。 待长出单菌落后，挑取菌落进行菌液PCR鉴定，出现阳性条带的菌落培养后进行菌液保存。

1.2.4 同源性比对及系统发育分析

将测序得到的立克次体ompB 基因和sca1 基因序列，运用SeqMan 软件进行核苷酸序列处理后再进行Blast 分析， 评估与已报道的序列的相似性， 使用MegAlign 软件进行序列间同源性比对。从GenBank 数据库下载参考序列及外群序列，通过MEGA 11.0 软件，使用邻接法（NJ）计算操作分类单元之间的遗传距离， 使用具有1 000 次迭代的自举过程，构建系统进化树。

1.3 不同地区蜱携带立克次体情况比较

运用Excel 2010 软件统计不同地区、 不同种类立克次体感染情况，利用公式计算相对优势度。相对优势度（Dr）=蜱携带的某种立克次体总数/蜱携带的立克次体总数×100%。 运用SPSS 27.0 统计学软件对不同地区立克次体感染率进行χ2检验，P<0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 立克次体ompB 基因及sca1 基因PCR 检测结果

采用PCR 法扩增立克次体ompB 基因和sca1基因， 经琼脂糖凝胶电泳仪分析， 分别在812 bp和657 bp 处出现阳性条带（见图1、图2），获得的阳性产物与预期片段大小一致。

图1 立克次体ompB 基因PCR 扩增结果

图2 立克次体sca1 基因PCR 扩增结果

2.2 立克次体ompB 基因序列比对及系统进化分析

立克次体ompB 基因测序结果经Blast 比对分析显示：主要存在2 种斑点热群立克次体，序列代表样品TP-544 与喀什地区叶城县检测到的西伯利亚立克次体（Rickettsia sibirica，GenBank 登录号：OM475652、OM475651、OM475650） 同源性为99.9%；序列代表样品TP-55 分别与阿克苏地区拜城县和乌什县以及石河子市分离出的马赛立克次体 （Rickettsia massiliae，GenBank 登 录 号 ：OM475664、MF002502、KY069248、OM475662） 同源性为99.9%（见图3）。

图3 立克次体ompB 基因序列同源性比对结果

以普氏立克次体（Rickettsia prowazekii）和猫立克次体（Rickettsia felis）为外群，基于立克次体ompB 基因构建系统发育树。 由图4 可知，序列代表样品TP-544 与西伯利亚立克次体亲缘关系很近，聚为一簇；序列代表样品TP-55 与马赛立克次体亲缘关系较近，聚为一簇。

图4 基于立克次体ompB 基因构建的系统进化树

2.3 立克次体sca1 基因序列比对及系统进化分析

立克次体sca1 基因测序结果经Blast 比对分析显示：主要存在2 种斑点热群立克次体，序列代表样品TP-527 分别与新疆维吾尔自治区拜城县、石河子市、 和田地区分离到的马赛立克次体（Rickettsia massiliae，GenBank 登录号：MF002499、KY069254、OP503169）同源性为100%；序列代表样品TP-537 与新疆维吾尔自治区和田地区检测到的暂定巴布瑞立克次体 （Candidatus Rickettsia barbariae，GenBank 登录号：OP503168、ON168948、MF002505）同源性为99.7%～99.8%（见图5）。

图5 立克次体sca1 基因序列同源性比对结果

以查菲埃立克体（Ehrlichia chaffeensis）和日本立克次体（Rickettsia japonica）为外群，基于立克次体sca1 基因构建系统发育树。 由图6 可知，序列代表样品TP-527 与马赛立克次体（Rickettsia massiliae）聚为一簇，且同源关系接近；而序列代表样品TP-537 与暂定巴布瑞立克次体（Candidatus Rickettsia barbariae）聚为一簇，且遗传距离接近。

图6 基于立克次体sca1 基因构建的系统进化树

2.4 不同地区蜱感染立克次体情况统计

由表2 可知，从阿克苏地区4 个县（市）采集的574 只蜱样品中共检测出87 份立克次体阳性样本， 总体阳性率为15.16%（87/574）； 在4 个县（市） 中， 温宿县蜱携带立克次体阳性率最高，为23.66%（22/93），沙雅县蜱携带立克次体阳性率最低，为4.08%（4/98）。 在检出的3 种SFGR 基因型中， 暂定巴布瑞立克次体为阿克苏地区立克次体优势种（Dr=44.83%，39/87）。 χ2检验结果显示，阿克苏地区不同县（市）蜱的立克次体感染率存在显著差异（P=0.001，χ2=15.834）。

3 讨论

蜱是专性吸血体外寄生虫，可以传播细菌、病毒、寄生虫、支原体［14］。在蜱媒立克次体疾病中，主要病原包括立氏立克次体、康氏立克次体、西伯利亚立克次体和非洲立克次体等［15］。蜱寄生在宿主体表期间，引起各种临床表现可能衍生其他疾病［16-17］。为更精确鉴别立克次体的种类， 本研究采用立克次体的ompB 基因和sca1 基因进行双重表征。

调查结果表明，阿克苏地区4 个县（市）均存在蜱感染立克次体的情况，总体感染率（15.16%，87/574）高于2017 年孙响等［18］报道的巴音郭楞蒙古自治州尉犁县的感染率（12.35%，63/510），低于2017 年李飞［19］报道的阿克苏地区库车市的感染率（16.1%，15/93）和2020 年郗宇［20］报道的阿克苏地区库车市、 阿瓦提县、 沙雅县的总体感染率（59.02%，36/61）。 通过与上述研究报道的数据比较， 发现蜱感染立克次体的情况在阿克苏地区近几年一直存在，但感染率呈下降趋势。

通过ompB 基因和sca1 基因系统发育分析，本研究中马赛立克次体与同地区乌什县、 拜城县分离得到的立克次体序列亲缘关系接近， 暂定巴布瑞立克次体与和田地区分离得到的序列相近。郗宇［20］也从阿克苏地区阿瓦提县、沙雅县及库车市检测到暂定巴布瑞立克次体。 本研究中西伯利亚立克次体与喀什地区叶城县分离得到的立克次体关系接近。喀什地区、和田地区及阿克苏地区同属塔克拉玛干沙漠周边地区，气候条件相近，蜱可通过牛羊交易等方式传播。从《伯杰系统细菌学手册》［8］对立克次体的分类不断更新推测，立克次体的种内变异速度很快。 本研究基于sca1 基因测序及比对结果鉴定出了暂定巴布瑞立克次体，而ompB 基因测序及比对结果未鉴定出暂定巴布瑞立克次体， 提示该病原还需通过立克次体其他基因的扩增来进一步确定。

4 结论

从阿克苏地区574 只牛羊体表蜱中共检测到3 种SFGR 基因型， 分别为暂定巴布瑞立克次体、西伯利亚立克次体、马赛立克次体，其中，暂定巴布瑞立克次体为优势种。 阿克苏地区为蜱及立克次体流行区，建议加强蜱及蜱传疾病的防控工作。