基于高效液相色谱法的儿童清肺丸中汉黄芩苷含量测定

褚莉,齐元春,孙利,李秀玲,段树卿

作者单位: 067000 河北省承德市,颈复康药业集团有限公司(褚莉、齐元春、孙利、李秀玲、段树卿) 067000 河北省承德市,河北省中药新辅料技术创新中心(褚莉、齐元春、李秀玲、段树卿)

儿童清肺丸是儿科临床常用内服丸剂,其组方由麻黄、黄芩、炒苦杏仁、石膏、甘草、蜜桑白皮、瓜蒌皮、板蓝根、橘红等22味中药材组成,具有化痰、止咳、解表、清肺功能,临床上用于小儿风寒外束、肺经痰热所致的面赤身热、痰多黏稠、咳嗽气促、咽痛声哑等症,疗效显著[1]。儿童清肺丸现行质量标准收载于《中国药典》2020年版一部,含量测定项下规定对黄芩苷进行检测[1]。除丸剂的常规检验外,儿童清肺丸质量控制相关文献中,有采用薄层色谱法对儿童清肺丸中麻黄及黄芩进行定性鉴别,或采用高效液相色谱法对儿童清肺丸中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱进行含量测定[2-3];药效学试验研究表明,儿童清肺丸具有良好的镇咳、化痰、平喘、解热、抗炎及抑菌作用[4-7]。黄芩中的主要活性成分黄芩苷、汉黄芩苷等,具有清热抑菌、抗炎解毒作用[8-9],与该药药理作用一致。结合分子生物学及化学方法对儿童清肺丸的物种组成进行鉴定研究,建议将马兜铃酸Ⅰ含量作为评价儿童清肺丸的控制指标性成分之一[10]。本研究建立高效液相色谱法测定儿童清肺丸中汉黄芩苷的含量测定方法,报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1 200型高效液相色谱仪(美国安捷伦,DAD检测器);色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18柱(4.6×150 mm,5 μm);十万分之一电子分析天平(梅特勒—托利多,型号:XSE205DU);数控超声波清洗器(昆山市超声仪器,型号:KQ-500DE)。

1.2 试药 对照品汉黄芩苷(批号:111760-201502,浓度:98.0%),来源于上海诗丹德生物技术有限公司;儿童清肺丸(批号分别为:W00101,W00102,W00103,W00104,W00105,W00106)来源于颈复康药业集团有限公司;乙腈(色谱纯,美国Fisher);磷酸(分析纯,天津佳兴化工玻璃仪器工贸有限公司);乙醇(分析纯,天津佳兴化工玻璃仪器工贸有限公司);水为三级反渗法制得纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);流动相为乙睛-0.4%磷酸溶液(27∶73);流速为1.0 ml/min;柱温为30 ℃;进样体积为10 μl;检测波长为276 nm;理论塔板数按汉黄芩苷峰计算应≥5 000。

2.2 溶液配制

2.2.1 对照品溶液的制备:精密称取汉黄芩苷对照品适量,使用70%乙醇溶液溶解,制成浓度为0.05 mg/ml的汉黄芩苷对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备:取儿童清肺丸样品适量,制成小颗粒状,混匀,取颗粒状的儿童清肺丸1.5 g,进行精密称定,放置于50 ml具塞锥形瓶中,加入70%乙醇溶液25 ml,密塞后称重,进行超声处理(功率500 W、频率40 kHz)45 min,冷却至室温再次称重,使用70%乙醇溶液补重,摇匀,滤过,续滤液再用0.45 μm滤膜过滤,即为供试品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液的制备:取儿童清肺丸处方中除黄芩药材的其他药材按比例及工艺制备缺黄芩阴性对照样品,按照“2.2.2”项下供试品溶液制备方法制备阴性样品溶液。

2.3 空白试验 分别精密吸取“2.2.1”“2.2.2”“2.2.3”项下的对照品、供试品、阴性样品溶液,按“2.1”项下色谱条件,依次进行色谱分析测定,记录色谱图。结果显示,在该色谱条件下,汉黄芩苷峰和相邻杂峰良好分离,阴性对照样品对检测结果无干扰,见图1、图2、图3。

图1 汉黄芩苷对照品空白试验色谱图

图2 供试品空白试验色谱图

图3 阴性样品空白试验色谱图

2.4 线性关系考察 取汉黄芩苷对照品适量,精密称定,加70%乙醇分别制成浓度为9.92、24.75、39.68、49.60、74.40 μg/ml的对照品溶液,按照“2.1”项下色谱条件进样,进样量为10 μl,以对照品的峰面积值为纵坐标(Y),以对照品的浓度值为横坐标(X),进行线性回归分析并绘制标准曲线,得到标准曲线的线性回归方程为Y=4 479.4X-15.097,r=0.999 8。试验结果表明,汉黄芩苷在9.92～74.40 μg/ml范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.5 精密度试验 精密吸取“2.2.1”项下汉黄芩苷(0.049 6 mg/ml)对照品样品溶液,按上述色谱条件进样,连续进样6次,记录色谱图峰面积,计算RSD值。结果显示,汉黄芩苷峰面积的RSD值为0.09%,提示仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 取儿童清肺丸(批号:W00101)粉末样品9份,精密称定,1～3每份1.25 g,4～6每份2.5 g,7～9每份5.0 g,按上述供试品溶液制备方法平行制备样品溶液,按上述色谱条件进样,记录色谱图峰面积,计算样品中汉黄芩苷含量及RSD值。结果显示,本批儿童清肺丸中汉黄芩苷平均含量为0.57 mg/g,RSD值为1.55%(n=9),提示该样品处理方法重复性良好。

2.7 稳定性试验 取复方石韦片样品适量,按上述供试品溶液制备方法平行制备样品溶液,按上述色谱条件进样,分别于0、1、2、3、4、5、6、7、8 h时进样,记录色谱图峰面积,计算RSD值。结果显示,汉黄芩苷峰面积的RSD值为0.23%,提示复方石韦片供试品溶液在8 h内稳定性符合要求。

2.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的同批次儿童清肺丸样品约0.75 g,精密称定,共9份,分别加入3种不同浓度的汉黄芩苷对照品适量,混匀,按上述供试品溶液制备方法平行制备样品溶液,按上述色谱条件进样,记录色谱图峰面积,计算加样回收率及RSD值,结果显示,汉黄芩苷平均加样回收率为100.92%,RSD值为1.08%。提示该方法准确度良好,见表1。

表1 汉黄芩苷加样回收率试验结果

2.9 检测限 取标准曲线工作液中浓度最低的对照品溶液,逐级稀释对照品溶液,按上述色谱条件进样,测得信噪比为3∶1时,确定检测限为0.000 072 38 μg。

2.10 定量限 取标准曲线工作液中浓度最低的对照品溶液,逐级稀释对照品溶液,按上述色谱条件进样,测得信噪比为10∶1时,确定定量限为0.000 258 5 μg。

2.11 样品含量测定 取待测的6批儿童清肺丸样品,按上述供试品溶液制备方法平行制备样品溶液,按上述色谱条件进样,计算样品含量。结果显示,6批儿童清肺丸中汉黄芩苷含量为0.55～0.64 mg/g,见表2。

表2 儿童清肺丸样品含量测定结果 (mg/g)

3 讨 论

3.1 不同提取溶剂的对比选择 根据黄酮类化合物性质,难溶于水,可溶于甲醇、乙醇,易溶于乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂的性质,本研究参照相关文献[10-17],分别考察了甲醇溶剂、70%甲醇溶剂、50%甲醇溶剂、乙醇溶剂、70%乙醇溶剂和50%乙醇为溶剂测定汉黄芩苷含量,结果甲醇溶剂、70%甲醇溶剂、50%甲醇溶剂、70%乙醇溶剂、50%乙醇溶剂的含量测定结果基本一致,由于甲醇溶剂毒性相较其他溶剂大,50%乙醇溶剂较其他溶剂溶液黏,不易过滤,因此选用70%乙醇溶剂为提取溶剂。

3.2 不同提取溶剂体积的对比选择 本研究考察了不同提取液(70%乙醇溶剂)体积分别为10 ml、25 ml、50 ml时对样品含量测定结果的影响,结果显示,当提取液体积为25 ml与50 ml时测得样品中汉黄芩苷的含量无明显差异,且均高于10 ml体积提取液时,说明提取溶剂加入25 ml的提取液已将样品提取完全。

3.3 不同提取时间的对比选择 本研究考察了不同超声时间:超声15、30、45、60 min对样品含量测定结果的影响,结果显示超声时间为30、45、60 min时测得样品汉黄芩苷含量无明显差异,且均高于15 min超声时间时,说明超声提取时间为30 min时提取液已将样品提取完全。

3.4 不同检测波长的对比选择 取汉黄芩苷对照品,精密称定,用70%乙醇溶液配制成适宜浓度的对照品溶液,采用高效液相色谱仪,DAD检测器在200～400 nm进行光谱扫描。结果表明,汉黄芩苷在276 nm的波长处有最大吸收,因此选择276 nm作为测定波长,见图4。

图4 汉黄芩苷全波长扫描紫外吸收光谱

3.5 不同流动相的对比选择 本研究参照相关文献[18-20],分别考察了(1)甲醇—水—磷酸(45∶55∶0.2)作为流动相;(2)乙腈-0.4%磷酸溶液(27∶73)作为流动相;(3)乙腈—水—磷酸(25∶75∶0.2)作为流动相进行洗脱。结果:甲醇—水—磷酸(45∶55∶0.2)作为流动相,可得到较好的分离效果,但汉黄芩苷出峰时间较晚。乙腈-0.4%磷酸溶液(27∶73)作为流动相,汉黄芩苷分离度、出峰时间都较好。乙腈—水—磷酸(25∶75∶0.2)作为流动相,汉黄芩苷的分离度低于甲醇—水—磷酸(45∶55∶0.2)、乙腈-0.4%磷酸溶液(27∶73)。因此选用乙腈-0.4%磷酸溶液(27∶73)作为流动相。

综上所述,本研究建立的儿童清肺丸中汉黄芩苷的含量测定方法,经方法学考察,表明该方法专属性强,精密度高,重复性好,准确性高,可用于儿童清肺丸中汉黄芩苷的含量测定,同时为儿童清肺丸的质量控制提供参考,对提高儿童清肺丸质量标准,提高整体质量控制水平,保证药物疗效稳定起到积极作用。

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