HPLC法同时测定不同产地半夏中7种核苷类成分的含量

彭加兵,张凤,范慢利,樊宗兵,王梦,严安定

半夏属于天南星科半夏属植物,能干湿化痰、降逆止呕、消痞散结,其生品有毒,临床上多经炮制而广泛应用,《中国药典》历版载之[1-3]。颍半夏产于安徽省阜阳地区颍上县、阜南县一带,为半夏道地品种[4-6]。调查研究发现,不同产地的半夏药材品质差异较大,而《中华人民共和国药典(2020版)》只收录显微鉴别和薄层鉴别,无含量指标的记载,导致含量均一性等不可控,最终影响临床疗效,因此制定相应的质量标准尤为重要[1,7]。文献检索发现,半夏主要含有核苷类、生物碱和挥发油等,其中核苷类成分具有多种生物活性,如抗病毒、抗肿瘤、抗心律失常等,可作为指标成分测定半夏含量[8-12]。目前关于半夏中核苷类成分的含量测定的报道文献相对较少且测定的种类也较少,同时鉴于该药产量低,用量大,野生资源少,栽培资源质量得不到保证。因此,本研究建立高效液相色谱(HPLC)法同时测定不同产地半夏中7种核苷类成分含量的方法,为半夏的品质控制提供理论基础。报道如下。

1 仪器与试药

超声波清洁机;安捷纶1200高效能液相色谱仪;高速离心机;十万分之一电子天平。对照品:鸟苷、胸腺嘧啶核苷、肌苷、尿苷、腺嘌呤、腺苷、尿嘧啶(批号分别为:BZP1496、BZP2002、BZP1502、BZP1517、BZP1537、BZP1500、BZP1917),均购自合肥博美生物科技有限公司,均≥98%;甲醇和乙腈为色谱纯;其余试剂均为纯解析。半夏样本分别购自安徽省颍上县、重庆市秀山土家族苗族自治县、河北省安国市和山东省菏泽市,共4批(编号分别为BX-001、BX-002、BX-003、BX-004),经安徽医科大学附属阜阳医院主任中药师鉴定为半夏正品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 选用C18色谱柱(赛默飞,5 μm,4.6 mm×250 mm);流动相为乙腈(A)-0.05%磷酸溶液(B),梯度洗脱(0～10 min,0.5%A～1.0%A;10～15 min,1.0%A～1.5%A; 15～30 min,1.5%A～5.5%A; 30～35 min,5.5%A～10.0%A; 35～45 min,10.0%A～15.0%A; 45～50 min,15.0%A～20.0%A);流速为1.0 ml/min;波长250 nm;柱温30 ℃;其进样量为10 μl,色谱图见图1、图2。

注:1.尿嘧啶;2.尿苷;3.腺嘌呤;4.肌苷;5.鸟苷;6.胸腺嘧啶核苷;7.腺苷图1 混合对照品HPLC图

2.2 混合对照品溶液的制备 精确称取鸟苷、胸腺嘧啶核苷、肌苷、尿苷、腺嘌呤、腺苷、尿嘧啶对照品,加10%甲醇溶解定容,分别得到浓度为0.225 9、0.264 8、0.161 4、0.208 2、0.188 8、0.111 3、0.205 0 mg/ml的母液。再分别取各对照品母液0.5 ml,分别置于2、5、10、15、20、100 ml棕色量瓶中,加10%甲醇定容,既得工作液。

2.3 供试品溶液的制备 精密称取过60目筛半夏粉末2 g,加入10%甲醇10 ml,称量,超声抽取45 min(功率250 W,频率35 kHz),冷却后称量,加入10%甲醇,补足减损量,摇匀,离心5 min(10 000 r/min),上清液经0.45 μm微孔滤膜过滤,即得。

2.4 线性关系考察 按本文色谱条件测定,分别精确吸取各浓度的混合对照品溶液10 μl,记录色谱峰面积。绘制标准曲线,进行线性回归,以混合对照品质量浓度(X)为横坐标,峰区(Y)为纵坐标。回归方程和线性区间见表1。研究表明,在各自的浓度范围内,各化合物之间有良好的线性关系。

表1 线性关系考察结果

2.5 精密度实验 按本文色谱条件连续6次测定,每次精确吸收混合对照品溶液10 μl进样,计算得到RSD。经测定,峰域内鸟苷、胸腺嘧啶核苷、肌苷、尿苷、腺嘌呤、腺苷、尿嘧啶的RSD分别为0.74%、0.81%、1.07%、0.90%、0.67%、0.70%、0.94%,表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性实验 按本文色谱条件在0、3、6、9、10、12、15、17、19、24 h分别取样10 μl测定编号为BX-001的供试品溶液,计算RSD。结果在24 h内供试品溶液中,鸟苷、胸腺嘧啶核苷、肌苷、尿苷、腺嘌呤、腺苷、尿嘧啶的峰区RSD分别为0.93%、0.83%、1.07%、1.25%、1.17%、1.28%、1.23%,具有较好的稳定性。

2.7 重复性实验 精密称取编号为BX-001半夏粉末2 g,平行称定6份,按照本文供试品溶液的制备方法制备供试溶液,在本文色谱条件测定条件下,测定半夏中鸟苷含量6.144 0 mg/g,RSD为1.03%;胸腺嘧啶核苷含量5.565 8mg/g,RSD为0.89%;肌苷含量3.046 3 mg/g,RSD为0.92%;尿苷含量25.082 5 mg/g,RSD为1.09%;腺嘌呤含量8.879 8 mg/g,RSD为1.18%;腺苷含量2.112 2mg/g,RSD为1.24%;尿嘧啶含量9.656 2 mg/g,RSD为1.11%,结果表明此方法具有良好的重复性。

2.8 加样回收率实验 按照本文供试品溶液的制备方法制备供试溶液,精密称取6份已知含量编号为BX-001半夏粉末,每份1 g,分别加入7种核苷的对照品,加入量与样品中待测成分含有量相当,计算回收率,见表2。

表2 加样回收试验结果 (n=6)

2.9 测定半夏核苷类成分含量 根据本文色谱条件测定,各取10 μl供试品溶液和混合对照品溶液,在半夏试样中按线性方程求出目标成分的含量,见表3。

表3 半夏样品指标成分含量测定结果 (mg/g,n=3)

3 讨 论

3.1 核苷类成分含量比较 半夏化学成分含量受产地影响较大,其结果影响疗效[13]。研究发现,7种核苷类成分在不同产地的半夏总含量差异较大,从高到低依次为河北省安国市(70.297 0 mg/g)、安徽省颍上县(60.486 8 mg/g)、山东省菏泽市(27.995 4 mg/g)、重庆市秀山土家族苗族自治县(16.014 6 mg/g),其中安徽省颍上县产地半夏所含尿嘧啶、尿苷和腺嘌呤均高于其他产地半夏,河北省安国市所产半夏中肌苷、鸟苷、胸腺嘧啶核苷和腺苷含量均高于其他产地半夏。结果表明河北省安国市和安徽省颍上县产地半夏种植前景较好,但由于取样数量相对较少,该数据是否具有代表性,有待扩大试验批次和产地进一步研究。

3.2 提取方法选择 研究发现,从半夏中提取核苷类成分常用提取溶剂为纯水,提取方法为超声提取法[11,13-14]。本实验考察了甲醇—水(100%甲醇,75%甲醇,50%甲醇,30%甲醇,10%甲醇,纯水)6种不同比例溶剂对提取核苷类成分的影响,结果显示以10%甲醇溶液对核苷类成分的提取效果最佳。浸出法对比了回流提取法和超声提取法,结果显示超声提取法较好。超声条件考察了功率、频率、提取时间,最优条件确定为功率250 W,频率35 kHz,提取45 min。

3.3 色谱条件优化 研究发现,常采用甲醇—水、乙腈—水、乙腈—0.05%磷酸溶液作为流动相,260 nm为检测波长,检测半夏多种核苷类成分的含量[4,13,15]。本实验将作为流动相的甲醇—水、乙腈—水、乙腈—0.05%磷酸溶液分别进行梯度洗脱,在各核苷类成分的峰型和分离度均较好的情况下,乙腈—0.05%磷酸溶液作为流动相。本实验在流动相为乙腈—0.05%磷酸溶液条件下采用赛默飞C18色谱柱进行条件优化,最终确定本文色谱条件。此外,本文对混合对照品溶液利用二极管阵列检测器(DAD)进行全波长扫描,各检测成分在波长250 nm和本文色谱条件下吸收较好、峰形最优、基线平稳,最终确定本文检测波长。

综上所述,本研究建立的HPLC法同时测定不同产地半夏中7种核苷类成分含量的方法简单快捷,所用的色谱条件通用性强,同时该方法具有良好的稳定性、重复性和精密度,既定性又定量,多指标含量测定为完善半夏质量标准提供了科学依据。

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