可降解PLA/PBAT塑料的微生物菌群结构研究

裴雯玉 江雨韩 李娜 陈怡 吴弘

摘要  为探究PLA/PBAT 复合材料在菌群处理下的降解情况，加快该塑料的生物降解速率。通过富集培养法筛选获得不同批次的可降解菌群，基于失重法评估不同批次菌群对于PLA/PBAT 复合材料的降解能力，并利用高通量测序分析批次间微生物的结构特点。结果发现，通过多轮富集后，在相同的处理周期内，PLA/PBAT塑料的失重率由2.52%提高到4.93%。转接多批次后在门分类水平上菌群丰度最高的 5 个菌门分别为拟杆菌门、浮霉菌门、变形菌门、装甲菌门和绿弯菌门，占比超过95.00%；在属水平上，丰度较高的分别为拟杆菌门OPB56属和浮霉菌门SH-PL14属。微生物群落结构随着不断的转接而趋于稳定。

关键词  PLA/PBAT塑料；失重率；高通量测序；菌群结构

中图分类号  X172  文献标识码  A  文章编号  0517-6611（2024）04-0057-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.04.012

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Study on the Microbial Community Structure of Degradable PLA/PBAT Composites

PEI Wen.yu， JIANG Yu.han， LI Na et al

（College of  Life Sciences，Tianjin Normal University，Tianjin 300387）

Abstract  In order to explore the degradation of PLA/PBAT composites under the treatment of bacteria， we analyzed the characteristics of microbiome and accelerated the biodegradation rate.  In this study， different batches of bacteria were screened and their degradation ability were evaluated based on weightlessness method. The characteristics of microorganisms among different batches were analyzed by high.throughput sequencing. The results showed that the weight loss of PLA/PBAT plastics increased from 2.52% to 4.93%.The five highest abundance at phyla level were Bacteroidetes， Planctomycetes， Proteobacteria， Armatimonadetes and Chloroflexi， accounting for more than 95.00%. OPB56 and SH.PL14 were the highest abundance at genus level. The microbial community structure tended to be stable.

Key words  PLA/PBAT plastics;Weightlessness rate;High.throughput sequencing;Flora structure

基金项目  天津市科学计划项目（18ZLZXZF00220）；天津市级“大学生创新创业训练计划”（202210065167）；天津师范大学引进人才基金项目（5RL147）。

作者简介  裴雯玉（2000—），女，山西长治人，硕士研究生，研究方向：微生物筛选。*通信作者，讲师，博士，从事微生物功能研究。

收稿日期  2023-02-24；修回日期  2023-03-30

近年来，可生物降解塑料在全球的需求激增，其不仅具备传统塑料的优越性能，还具有良好的生物相容性和可降解性［1-2］，对于生态环境保护、经济可持续发展具有重要的研究价值［3-4］。聚乳酸（PLA）和聚对苯二甲酸-己二酸-丁二酯（PBAT）混合后形成的PLA/PBAT共聚物是目前可生物降解塑料中研究较多的材料之一［5-6］。然而越来越多关于生物降解型塑料膜的研究发现，如果在环境中降解不完全，形成的微塑料会造成比普通塑料还要大的环境隐患［7-8］。因此，深入研究生物降解型塑料的降解机制，发掘更高效的生物降解系统显得尤为迫切。

目前，科研工作者一直通过努力筛选高效塑料降解菌来实现完全的微生物降解。据报告，Jia等［9］从农田土壤中筛选分离了一种能够降解PBAT的Stenotrophomonas sp.YCJ1，在pH 7.5时该菌的降解率最高，脂肪酶活性达到5.17 U/mL。Kasuya等［10］在自然条件下筛选了一株能够单独降解PBAT的真菌NKCM1712；Satti等［11］在30 ℃条件下筛选鉴定出3种菌株能高效降解PLA，包括Chryseobacterium sp.、Sphingobacterium sp.以及Pseudomonas aeruginosa。Urbanek等［12］从极端环境北极极地土壤样品中分离筛选得到Rhodococcus sp.，可以降解包括PLA在内的生物可降解塑料。但是单株菌的作用始终有限，尚未取得理想的效果，因此，开发和利用混合微生物体系来消除培养后期次级代谢产物对单一菌株的限制，提高塑料的降解效率成为了研究的新方向和新热点［13-14］。混菌体系降解塑料的研究也有报道，Jia等［15］开发了假单胞菌与秀丽放线菌的共培养体系，协同作用下实现了对PLA/PBAT复合材料薄膜的高效降解。Auta等［16］发现芽孢杆菌和紅球菌混合后对于聚乙烯的降解效果要比单独菌株强。因此，进一步挖掘可以高效降解PLA/PBAT复合材料的菌株，研究其组成特点和协同作用的关系，对于提高环境中塑料的降解效率具有重要意义［17-19］。

该研究从塑料污染严重地区采集土壤样品，利用选择性培养基筛选并富集PLA/PBAT塑料膜高效降解菌群，对塑料膜降解过程中各代菌群结构的动态演替规律进行了分析和对比研究，探索可降解PLA/PBAT塑料的核心微生物物种。以期为降解菌群的富集条件优化和降解微生物特性研究奠定基础，提高PLA/PBAT复合材料的生物降解效率。

1  材料与方法

1.1  试验材料和土壤样品

PLA/PBAT复合塑料膜采购自东莞市三燕塑胶原料有限公司。该研究所使用的土壤样品采集自湖南省衡阳市垃圾场附近。选择垃圾沉积时间较长的区域，基于五点取样法，将收集的土壤样品贮存于灭菌的透明封口袋内并编号，迅速带回实验室进行后续处理。

1.2  培养基

1.2.1

Luria-Bertani（LB）培养基。蛋白胨10.00 g/L，酵母提取物5.00 g/L，氯化钠19.00 g/L，氢氧化钠溶液调节pH至7.4。121 ℃灭菌 20 min。

1.2.2

无机盐培养基。K2HPO4 0.700 g/L、KH2PO4 0.700 g/L、MgSO4·7H2O 0.700 g/L、NH4NO3 1.000 g/L、NaCl 0.005 g/L、FeSO4·7H2O 0.002 g/L、ZnSO4·7H2O 0.002 g/L、MnSO4·H2O 0.001 g/L，调节pH至7.0，121 ℃灭菌 20 min。

1.3  降解菌群的筛选和转接富集

首先将PLA/PBAT复合塑料膜制备成大小规格为 10 mm×10 mm 的薄片，在 2% SDS 中浸泡过夜，随后在75%酒精中浸泡4 h，用无菌水冲洗干净备用。称取10 g土样于90 mL无菌水中，制得土壤稀释液。放置3片PLA/PBAT薄膜到180 mL無机盐培养基中，制备成以PLA/PBAT复合塑料膜为唯一碳源的培养环境，然后按照10%的接种量取20 mL土壤稀释液到培养基中，在37 ℃摇床中连续培养22 d（该试验以22 d为一个降解周期），观测PLA/PBAT塑料膜在液体培养基中的崩解情况。选择未添加土壤稀释液的PLA/PBAT塑料膜-无机盐液体培养基作为空白对照组。

第一个降解周期培养结束后，继续富集转接时，将 10%（20 mL）的培养液转接入新的PLA/PBAT复合塑料膜-无机盐液体培养基中，37 ℃培养22 d，共转接3次，得到3个批次培养液（初始菌液记为G0，第1次转接后的菌液记为G1，第2次和第3次转接后的菌液分别记为G2和G3）。

1.4  PLA/PBAT塑料膜失重率

一个降解周期培养结束之后，在超净台中将三角摇瓶打开，将PLA/PBAT复合塑料膜用75％的酒精和无菌水冲洗2遍。晾干之后测定降解后的PLA/PBAT塑料膜质量，并计算失重率。

失重率（%）=PLA/PBAT塑料膜纯损失质量/培养前塑料膜质量×100

通过摇瓶培养前后塑料膜重量的变化来计算失重率，失重率越高，则说明塑料膜的降解效果越好。

1.5  DNA提取和高通量测序

取每个批次（G0、G1、G2和G3共计4个批次）的菌体进行收集，用细菌全基因组提取试剂盒（TIANGEN，中国）完成菌群 DNA的抽提，并通过琼脂糖凝胶电泳检测，随后将样本送至上海美吉生物有限公司开展高通量测序。

选取细菌 16S rRNA 的 V4～V5 区进行高通量测序分析。首先利用通用引物 5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′和5′-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3′进行PCR 扩增，扩增回收后在 Illumina HiSeq 2500测序平台上完成高通量测序分析。然后对测得的原始数据进行处理，包括拼接、质控、抽平等，获得的序列以 97%相似性生成 OTU（operational taxonomic units），再使用Silva 128 数据库比对，得到物种信息注释的基本情况。

1.6  生物信息学统计分析

采用 UPARSE 软件进行 OTU 聚类后，将微生物在门、纲、目、科、属、种分类水平上进行群落结构的统计分析，利用 R 语言（Version 3.4.1）进行统计学分析，计算细菌群落的 α-多样性指数，包括Observed OUT 和 Shannon指数等，并基于加权和非加权分析不同批次细菌群落的 β-多样性指数。

2  结果与分析

2.1  PLA/PBAT塑料膜高效降解菌群的富集和筛选

该研究共采集35份土壤样本，将土壤稀释液接种于PLA/PBAT复合塑料膜-无机盐液体培养基中进行富集培养。37 ℃培养22 d后，发现其中1个摇瓶出现PLA/PBAT塑料膜破碎的现象，说明该土壤样本中具备能够降解PLA/PBAT塑料膜的微生物菌群，将其作为初始的研究菌群，记为G0。随后将G0接种至新的PLA/PBAT复合塑料膜-无机盐液体培养基，转接后获得第一批次（记为G1），第2批次（记为G2）和第3批次（记为G3）的菌液。

在培养过程中定期观察降解膜的状态，结果显示，在未进行任何处理的情况下，PLA/PBAT塑料膜表面较为平整，有韧性。而第1次转接菌液培养22 d，PLA/PBAT塑料韧性逐渐消失，易于破碎；经过第2批次菌液处理后可观察到塑料4周发生破损，表面有裂纹；直到在第3批次G3菌群的处理下，可以明显发现PLA/PBAT塑料发生完全崩解破碎（图1）。由此可见，菌群降解能力随着富集代数的增加而增强。

检测塑料膜的失重率，结果发现，G0菌群在22 d后塑料膜的失重率为 2.52%，而到了第3批次G3，转接处理同样的天数，塑料失重率高达 4.93%（图1），说明G3批次的微生物降解PLA/PBAT塑料的效果越好。

2.2  转接富集中高效降解菌群的结构变化

将G0、G1、G2、G3的菌液提取DNA后进行建库测序分析，结合16S rRNA高通量测序的结果，分析G0、G1、G2、G3的微生物群落结构。利用韦恩分析发现，各组共有的OTU个数为75，而特有的OTU在不同批次的微生物中差异较大，G0、G1、G2、G3各自特有的数目为167、83、21、17（图2）。 随着转接次数的增加，菌群中特有的OTU数目呈现出减少的趋势。

分析各个批次菌群的结构组成，结果显示：门水平上，G0

中的优势菌依次是变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门

（Acidobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、浮霉菌门（Planctomycetes）、厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria），相对丰度分别为50.15%、9.50%、 6.57%、6.38%、5.75%和

5.37%，所占比例高達83.00%以上。随着连续转接富集到G3，其优势菌门为拟杆菌门（Bacteroidetes）、浮霉菌门（Planctomycetes）、变形菌门（Proteobacteria）、装甲菌门（Armatimonadetes）和绿弯菌门（Chloroflexi），相对丰度分别为 39.57%、20.10%、15.55%、10.40%和 9.73%，这5个优势菌门所占比例达到95.00%以上，远远高于其他门水平（图3）。

因此，在逐代转接的过程中，变形菌门、疣微菌门（Verrucomicrobia）、酸杆菌门（Acidobacteria）的占比随着转接次数的增加而减少；而拟杆菌门（Bacteroidetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、浮霉菌门（Planctomycetes）、装甲菌门（Armatimonadetes）则随着转接次数的增加而增加，说明这4个门的菌株能够适应逐代的降解过程，并且发挥出良好的降解性能，尤其是浮霉菌门（Planctomycetes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）。

根据门分类水平上群落组成结构结果分析可知，拟杆菌门为PLA/PBAT塑料降解的优势菌门，这与他人对塑料降解菌群的研究一致，拟杆菌门的细菌是多糖的主要降解者［20-21］。孙超岷等［20］研究发现，深海冷泉拟杆菌可通过降解藻类多糖促进深海营养和碳循环，并通过转录组学和代谢组学联合分析了该菌株的降解和利用机制。在拟杆菌门的研究中，其编码碳水化合物酶的基因数量明显高于变形菌门和绿弯菌门中的细菌［21］。

从属水平对不同转接代次的微生物群落结构进行分析，比较菌群结构组成可以发现，不同转接批次的微生物群落相对丰度不同，存在一定的差异。从G0到G3，其微生物在属水平上差异较大，拟杆菌门OPB56属、绿弯菌门厌氧绳菌属、浮霉菌门SH-PL14所占比例随着转接富集的次数增加而明显升高，分别由6.57%升至39.57%、由3.43%升至9.73%和由6.38%升至20.10%（图4）。该结果说明这3个菌属在富集转接的过程中适应了以PLA/PBAT塑料膜为唯一碳源的培养条件，并逐渐成为降解PLA/PBAT塑料膜的优势菌群，后续将会继续深入研究这3个菌属的基因组特点。拟杆菌门OPB56属在转接富集过程相对丰度逐渐升高，比较G0和G3可以发现其占比具有显著性差异。这和之前研究发现拟杆菌门可能是降解PLA/PBAT塑料的潜在细菌类型是一致的。至于其具体的降解机制，还需要结合宏基因组学、代谢组学等多手段进行深入的研究，发掘可能的降解基因或者降解机制。

2.3  PLA/PBAT塑料地膜高效降解菌群转接富集结果

为了更进一步发掘微生物降解PLA/PBAT塑料膜的机制，使用 Mothur 软件计算不同批次PLA/PBAT塑料膜降解菌群的特点，开展阿尔法和贝塔多样性分析，各样品细菌群落的 α-多样性指数见表1。在Shannon指数和Chao指数的比较中，可以发现G0和G3存在显著差异。经过多次转接后，菌群的丰富度和多样性都降低了，整个菌群结构趋于单一化，这是微生物适应PLA/PBAT复合材料为唯一碳源的调整。

同时，对不同批次的微生物菌液进行基于 Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA），结果见图 5。从图5可以看出，基于 unweighted Unifrac 距离的 PCoA 分析中，第一主坐标轴的解释度为54.06%，第二主坐标轴的解释度为 25.21%；而基于 weighted Unifrac 距离的 PCoA 分析中，第一主坐标轴的解释度为 67.21%，第二主坐标轴的解释度为 20.09%。无论采用加权还是非加权的算法，4个批次的样品分为明显的4个区域，这表明不同批次间的微生物群落构成具有较大差异。

2.4  不同代次之间的微生物关系分析

每个门的代表属基本符合各门的数量变化规律，只有个别代表属的数量变化规律不符合所属门的变化规律。数量变化较为明显的10个属中，MND1、Aquicella、Subgroup_6_unclassified、Pedosphaeraceae_unclassified 4个属的数量随着转接次数的增加而减少，说明该4个属不适应膜降解的环境；而Fimbriimonadaceae_unclassified、OPB56_unclassified、Anaerolineaceae_unclassified、OLB13、SH-PL14、Armatimonadetes_unclassified 6个属的数量随着转接次数的增加而增加，说明该6个属适应了降解PLA/PBAT塑料膜的环境（图6）。占比较大的拟杆菌门（Bacteroidetes）和浮霉菌门（Planctomycetes）所对应的OPB56_unclassified和SH-PL14也是占比较大的属。同时，其他菌属的占比随着转接代数的增加而减少，说明了菌群结构的集中化。

3  结论和讨论

PLA/PBAT复合塑料是一种环境友好型材料，但是目前的研究表明其在短期或中期很难实现土壤中的完全降解。为了提升其生物处理的速度，开发高效的降解体系以及探究降解的机制显得尤为重要［22-23］。

该研究通过筛选土壤中具备降解能力的微生物菌群，并通过多代富集来分析塑料降解微生物的组成特点以及降解机制，结果发现：①通过多轮富集后，微生物降解PLA/PBAT复合塑料的效率提高了，22 d的降解周期内，失重率由252%提高到4.93%；②通过高通量测序分析不同转接代次微生物的结构组成，随着转接次数的增加，优势菌株的占比增大，特有菌属的数量在降低；③在门分类水平上，转接富集多次后（G3）的菌群丰度较高的 5 个菌门分别为拟杆菌门、浮霉菌门、变形菌门、装甲菌门和绿弯菌门，占比超过95.00%；在属分类水平上，丰度较高的菌属分别为拟杆菌门OPB56屬和浮霉菌门SH-PL14。

该研究利用高通量测序对从垃圾厂附近采集的土壤进行了多轮富集培养，获得了一个能够高效降解PLA/PBAT复合塑料的菌群，并通过分析微生物的组成发现群落结构随着不断的转接而趋于稳定，优势菌属的特征明显。在富集培养初期，由于群落需要一定的适应性，因而菌群群落结构变化较大，而随着转接的次数增加，能够降解PLA/PBAT复合塑料的菌群逐渐成为优势菌属，这些都是潜在的塑料降解菌，其降解机制还需要进一步探究。

下一步要继续研究不同种微生物的共培养体系，提高PLA/PBAT塑料的降解率。

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