基于高通量测序技术对三种太岁样品细菌组成的分析

王朝江++王世清

摘要：利用Illumina公司MiSeq技术，检测3种太岁样品细菌群落的差异性，分析太岁样品的细菌多样性和群落结构，揭示细菌在太岁构成中的作用和在不同太岁间的内在联系。结果表明，3种太岁样品的高通量测序分析共得到有效序列64 114条，归为4 033个OTU，属于35个门、61个纲、89个目、201个科及625个属，还有一些未有明确的分类学信息。变形菌门和厚壁菌门为优势门，在2、8、9号太岁样品中所占比例分别是63.95%、79.65%、76.82%。2、8、9号太岁中的最优势属及所占比例分别为Edaphobacter （23.84%）、梭菌属（12.94%）、芽孢杆菌属（17.60%）。3种太岁样品各自的优势属不尽相同，没有共有且占比均大的属。3种太岁样品的细菌群落的多样性丰富，且三者的细菌组成差异较大，不能建立起明显的内在联系。

关键词：太岁；细菌多样性；高通量测序

中图分类号：Q93 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）13-2543-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.13.037

Analysis of Bacterial Diversity and Community Structure from Three Taisui Based on High-throughput Sequencing

WANG Chao-jiang1，WANG Shi-qing2

（1. Institute of Genetics and Physiology of Hebei Academy of Agriculture and Forestry Science， Shijiazhuang 050051， China；

2. Shijiazhuang No.44 Middle School， Shijiazhuang 050051， China）

Abstract： By Miseq technology of Illumina company， the bacterial community structure from three samples were studied. The bacterial diversity and community structure were analysised in order to identify the role of bacteria in composition of Taisui and internal relations between different Taisui. 64 114 non-redundant sequences were obtained which were classified into 4 033 OTUs. These OTUs were belonged to 35 phyla， 61 classes， 89 orders， 201 families， 625 genera， and some unclassification groups. In the sample numbered 2， 8， 9， the dominant phyla were Proteobacteria and Firmicutes， respectively the proportions of two phyla were 63.95%， 79.65%， 76.82%. The most dominant genus in the sample numbered 2， 8， 9 was Edaphobacter （23.84%）， Clostridium （12.94%） and Bacillus （17.60%） respectively. The dominant genera were different from each other and there was no common preponderant genus. High bacterial diversities were found in all samples， also great differences existed between them， and there were no clear internal relations to be established between different samples.

Key words： Taisui；bacterial diversity；high-throughput sequencing

“肉芝状如肉，乃生物也，白者如截肪，黄者如紫金，皆光明洞彻如坚冰也”[1]。根据《本草纲目》中对太岁的描述，民间把1992年在中国陕西周至渭河滩发现的第一个肉团状不明物体及后来在河北、天津、山西、北京、吉林、新疆、内蒙古、甘肃等地发现的多个不明物体称之为太岁。目前，太岁在生物界的地位尚没有科学定论，仅少数学者在不同方面进行了初探。郑科研等[2]和朱春玉等[3]在其化学构成及生物学组分方面进行了研究。在其微生物构成方面，戴璐[4]利用培养方法得到了2种黏菌，并用平板培养结合克隆文库及T-RFLP得知渭河太岁衍生体是由18种真菌组成；王欣[5]分离培养了同一样本中的细菌获得35株细菌和1株黏细菌，并用T-RFLP发现其中还有蓝细菌。林涧等[6]用平板培养了2种太岁得到了假丝酵母菌、黏质红酵母和根癌农杆菌，2种太岁克隆文库各得到3个属的细菌。本研究笔者曾针对1种太岁构建了完整的16S rDNA克隆文库，发现太岁样品中细菌多样性较丰富，且蕴藏着许多未知的微生物资源。

高通量测序技术（High-throughput sequencing）具有通量高、速度快、准确度高以及运行成本低等特点，能够弥补克隆文库方法的工作量量大、信息量少等不足，已被广泛应用于生命科学的各个领域，尤其是可以系统地研究不同个体或环境中微生物菌群结构和多样性，对于全面、深入地认识了解个体、环境及其与微生物的关系有明显的推动作用。近年来，利用高通量测序技术对包括人体[7]、动物[8]、植物、昆虫[9]、海洋生物、土壤[10]、活性污泥[11]等相关的微生物群落多样性研究都已开展，而對太岁的研究结果鲜见报道。本研究利用Illumina公司MiSeq技术，对3种不同产地和形态的太岁深层组织内细菌群落多样性异同进行分析，为揭示太岁的微生物构成及不同太岁的内在联系提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

3株太岁分别产自山东青岛、新疆伊犁、河南三门峡，编号为2、8、9。2号太岁采集于河道淤泥上，重350 kg，长椭圆体，极富弹性，内部组织如熔融玻璃，溶于水；8号太岁采集于牧场表土层，重15 kg，扁枕头状，质如猪肥肉膘；9号太岁采集于黄河岸边，重20 kg，具尖圆柱体，质如硬橡皮，表皮和内部组织褐色。为避免保藏阶段外源菌感染干扰，提取DNA的样品取样位置在表层下2～3 cm处，重0.2 g。

1.2 DNA提取和扩增

使用OMEGA公司E.Z.N.A Soil DNA试剂盒提取样品的总基因组DNA。利用琼脂糖凝胶检测DNA完整性。采用引物341F（5′-CCTACGGGNGG- CWGCAG -3′）和805R（5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′）扩增细菌16S rDNA的V3-4区片段[12]。PCR反应体系50 μL：5 μL 10×PCR buffer，0.5 μL dNTP（10 mmol/L），10 ng基因组DNA，0.5 μL引物F（50 μmol/L），0.5 μL引物R（50 μmol/L），0.5 μL Plantium Taq（5 U/μL）。PCR反应程序如下：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，45 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s，5个循环，94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，20个循环，72 ℃延伸5 min。第二轮扩增，引入Illumina桥式PCR兼容引物。每个样品做3个重复，PCR产物切胶回收纯化并用Qubit 2.0检测DNA浓度，同一样品PCR产物等量混合后测序。

1.3 测序及数据处理

使用Miseq平台测序，测序序列中含有barcode序列，以及测序时加入的引物和接头序列。首先需要去除引物接头序列，再根据PE reads之间的overlap关系，将成对的reads拼接成一条序列，然后按照barcode标签序列识别并区分样品得到各样本数据，最后对各样本数据的质量进行质控过滤，得到各样本有效数据。

1.4 数据分析

1.4.1 测序数据优化 使用Usearch去除预处理后序列中非扩增区域序列，而后对序列进行测序错误校正，并调用Uchime进行鉴定嵌合体。随后，将去除嵌合体的序列与数据库代表性序列进行Blastn比对，低于阈值的比对结果被认为是靶区域外序列，并进行剔除。

1.4.2 OTU聚类与分类学分析 将所有样本序列按照序列间的距离进行聚类，根据序列之间的相似性将序列分成不同的操作分类单元（OTU，Operational Taxonomic Units）。采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似度水平的OTU代表序列进行分类学分析，得到每个OTU对应的物种分类信息，并在界、门、纲、目、科、属水平统计各个样品的菌落组成。

1.4.3 细菌的多样性分析 通过对单个样品中物种多样性的分析（α多样性）可以反映细菌群落的丰度和多样性，包括计算群落分布丰度（Community richness）的指数Chao值（http：//www.mothur.org/wiki/Chao）和ACE值（http：//www.mothur.org/wiki/Ace），计算群落分布多样性（Community diversity）的Shannon指数（http：//www.mothur.org/wiki/Shannon）及Simpson指数（http：//www.mothur.org/wiki/Simpson）。

2 结果与分析

2.1 样品测序深度验证

稀释曲线（Rarefaction curve）反映了样品的取样深度，可以用来评价测序量是否足以覆盖所有类群。用样品丰富度和Shannon指數做稀释曲线（图1、图2）。由图1、图2可知，3个样品丰富度稀释曲线均基本趋于平缓，但仍未达到饱和，而Shannon指数的稀释曲线已经进入平台期，这说明本次高通量测序达到了测序要求，能够较真实地反映样本的细菌群落，不过仍有少量微生物种类尚未被发现。

Coverage（http：//www.mothur.org/wiki/Coverage）表示各样品文库的覆盖率，其数值越高，则样本中序列没有被测出的概率越低。该指数实际反映了本次测序结果是否代表样本的真实情况。计算公式如下：

C=1-■

式中，n1为只含有一条序列的OTU数目，N为所有个体数目，此处为序列总数。2号、8号、9号太岁样品的覆盖度分别为0.940 5、0.969 0、0.947 3，太岁样品的覆盖度均高于0.940 0，说明本次测序结果均能较好地反映样本的真实情况。

2.2 细菌的多样性

对3个样品的高通量测序，共得到有效序列 64 114条，共归类为4 033个OTU，它们归属于35个门、61个纲、89个目、201个科及625个属，还有一些未有明确的分类学信息。其中2号样品得到有效序列20 883条，归类为1 856个OTU；8号样品得到有效序列16 672条，归类为788个OTU；8号样品得到有效序列26 606条，归类为2 040个OTU。如表1所示，每个样品在不同分类水平上的种类数量都很丰富，说明3个样品细菌都有丰富的多样性。表2显示每个样品的群落丰度都很高，并且根据Shannon指数和Simpson指数可以看出它们有丰富的细菌群落多样性。

2.3 细菌群落的组成分析

如图3显示，2号样品细菌群落的优势门是厚壁菌门（Firmicutes，34.00%）、变形菌门（Proteobacteria，29.95%）、酸杆菌门（Acidobacteria，27.84%）、拟杆菌门（Bacteroidetes，3.24%）。8号样品细菌群落的优势门是变形菌门（44.47%）、厚壁菌门（35.18%）、拟杆菌门（12.72%）、浮霉菌门（Planctomycetes，3.39%）。9号样品细菌群落的优势门是变形菌门（46.48%）、厚壁菌门（30.34%）、拟杆菌门（18.93%）、放线菌门（Actinobacteria，1.78%）。其中变形菌门和厚壁菌门在3个样品中都占主要优势，这2个门在2号、8号和9号3个样品中所占比例分别是63.95%、79.65%和76.82%。

表3是各个太岁样品中丰度大于1%的目及其所占比例，2号样品丰度大于1%的目有15个，8号样品丰度大于1%的目有14个，9号样品丰度大于1%的目有13个。3个样品共有的丰度大于1%的目有梭菌目（Clostridiales）、拟杆菌目（Bacteroidales）、芽孢杆菌目（Bacillales）、假单胞菌目（Pseudomonadales）、伯克霍尔德氏菌目（Burkholderiales）、鞘鞍醇单胞菌目（Sphingomonadales）、根瘤菌目（Rhizobiales）、肠杆菌目（Enterobacteriales）、乳杆菌目（Lactobacillales）。2号样品的优势目是芽孢杆菌目（25.86%）和假单胞菌目（11.66%），8号样品的优势目是梭菌目（26.38%）和红螺菌目（Rhodospirillales，15.39%），9号样品的优势目是芽孢杆菌目（20.49%）和拟杆菌目（14.48%）。

图4是属水平上的每个太岁样品的细菌群落组成。由图4可知，3个样品的细菌群落构成有很大差异，其在属的水平上未有明确分类信息的类群所占比例也不同。8号样品中未有明确分类信息的占13.81%，2号和9号样品中未有明确分类信息的分别占2.59%、2.88%。

3个太岁样品优势属也不相同，2号样品的优势属是Edaphobacter（23.84%），芽孢杆菌属（Bacillus，22.04%），假单胞菌属（Pseudomonas，8.07%）；8号样品优势属为梭菌属（Clostridium，12.94%），固氮螺菌属（Azospirillum，9.44%），假单胞菌属（5.73%）；9号样品的优势属是芽孢杆菌属（17.60%），假单胞菌属（7.64%），生丝单胞菌属（Hyphomonas，7.38%）。而且2号、8号和9号样品中丰度各在前3位的属所占比例分别是53.95%、28.11%和32.62%。在3个太岁样品中共有的属（丰度>1%）只有3个：芽孢杆菌属、假单胞菌属和鞘鞍醇单胞菌属（Sphingomonas）。芽孢杆菌属在2号、8号和9号样品中所占比列分别是22.04%、4.31%、17.60%，其丰度排位是2、4、1；假单胞菌属在2号、8号和9号样品中所占比列分别是8.07%、5.73%、7.64%，其丰度排位是3、5、2；鞘鞍醇单胞菌属在2号、8号和9号样品中所占比列分别是1.34%、2.11%、5.60%，其丰度排位是12、12、5。这表明没有一种细菌在各自太岁样品中占绝对优势（丰度>60%），且3个太岁样品在细菌属的组成上有很大差异，缺乏占比例高的共有类群。

从3个样品的韦恩图（图5）可以看出，它们的并集是143个OTU，2号和8号样品交集是173个OTU，2号和9号样品的交集是393个OTU，8号和9号样品的交集是239个OTU。各个样品的交集较少，说明这3个太岁样品相同OTU较少，但是相对来说2号和9号交集较多。

3 讨论

本研究采用高通量测序技术分析了3种太岁样品的细菌群落组成及多样性。3个太岁样品的4 033个OTU归属于35个门、61个纲、89个目、201个科及625个属，还有一些未有明确的分类学信息。Shannon指数和Simpson指数表明3个太岁样品都有丰富的细菌多样性。本研究3个太岁样品的Shannon指数分别是3.944 8、4.229 1、4.703 3，较长春太岁的Shannon指数2.22大[7]，说明3个样品的细菌多样性更丰富。

在细菌的群落结构上，3个太岁样品的优势门是变形菌门和厚壁菌门，所占比例大于60%，与长春太岁结果相一致。而3种太岁的优势属有很大差异，2号样品的优势属是Edaphobacter、芽孢杆菌属、假单胞菌属；8号样品优势属为梭菌属、固氮螺菌属、假单胞菌属；9号样品的优势属是芽孢杆菌属、假单胞菌属、生丝单胞菌属。用16S rDNA克隆文库方法得到的长春太岁的优势属为短波单胞菌属、葡萄球菌属和食酸菌属，与本研究3种太岁优势属也不相同，这说明不同太岁样品的细菌的优势属并不相同，这可能与太岁生长的环境有关。另外，3个太岁各自的优势属中没有1种占绝对优势（丰度大于60%），排名前三位属的丰度相加，2号接近60%，8号9号仅30%；共有的3个属（丰度大于1%），丰度没有同时位列前三，共有且丰度最靠前的芽孢杆菌属在8号丰度仅排第4位，不存在共有且占比均大的属；OTU并集少，说明3种太岁样品的细菌群落结构差异较大。所以，可以大胆推测，细菌尤其是本研究所用引物测得的细菌，不是太岁本体的根本组成，而是其同生境共存微生物。不同产地形态太岁之间，不大可能依靠細菌建立起内在联系。因此，为揭示太岁生命本质，需要更改引物或探讨除细菌之外的其他微生物组成。

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