黑木耳菌丝老化过程中生理酶变化及其与胞外酶相关性分析

庞杰 于传宗 李亚娇 王海燕 孙国琴

摘要  研究黑木耳菌丝老化过程中生理酶的变化，以及生理酶与胞外酶的相关性，结果表明：黑木耳菌丝老化过程中过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）呈先上升后下降的趋势，多酚氧化酶（PPO）、丙二醛（MDA）和脯氨酸（Pro）均呈下降趋势。通过相关性分析发现，胞外酶与抗氧化酶系统、MDA、Pro存在相关性，表明抗氧化酶系统与胞外酶系统存在内在联系，这有待进一步进行研究。

关键词  黑木耳菌丝体；老化；生理酶；胞外酶

中图分类号  S646.6  文献标识码  A  文章编号  0517-6611（2024）04-0027-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.04.007

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Changes of Physiological Enzymes and Their Correlation with Extracellular Enzymes During the Aging of Auricularia auricula Hypha

PANG Jie， YU Chuan.zong， LI Ya.jiao et al

（Inner Mongolia Academy of Agricultural & Animal Husbandry Sciences， Hohhot， Inner Mongolia 010030）

Abstract  This study investigated the physiological enzyme changes during the aging process of Auricularia auricula mycelium and their correlation with extracellular enzymes， it was found that the peroxidase （POD）， superoxide dismutase （SOD） and catalase （CAT） of Auricularia auricula myceliumhypha increased first and then decreased， while the polyphenol oxidase （PPO）， malondialdehyde （MDA） and proline （Pro） all decreased. Through correlation analysis， it was found that there was a high correlation between extracellular enzyme and antioxidant enzyme system， MDA， Pro， indicating that there was an internal relationship between antioxidant enzyme system and extracellular enzyme system， which needs further research.

Key words  Auricularia auricula mycelium;Aging;Antioxidant enzyme;Extracellular enzyme

基金項目  2021内蒙古自治区自然基金项目“老化过程对黑木耳菌丝体胞外酶和代谢组学的影响”（2021BS03047）；2022年内蒙古科技计划项目“内蒙古黄河流域日光温室食用菌工厂化生产及秸秆基质开发与利用技术研究”（2022YFHH0110）；2022年内蒙古农牧业科学院创新基金项目“自治区特色优势食用菌工厂化高效栽培技术研究与基础”（2022CXJJN01-2）。

作者简介  庞杰（1986—），男，蒙古族，内蒙古呼和浩特人，副研究员，博士，从事食用菌种质资源与种质创新研究。*通信作者，研究员，从事食用菌种质资源与种质创新研究。

收稿日期  2023-05-09

老化是食用菌生产中最常发生的问题之一，老化的菌种生命力下降，抗杂菌能力弱，出耳迟，直接影响到菌丝的生长及子实体的产量和品质［1-2］。由于老化现象存在一定的隐蔽性，大量研究集中在形态观测上［3-4］，目前还缺乏相关量化的生理观测指标，对于黑木耳菌丝老化生理也有待进一步研究。

菌种生理活性指标是通过一系列生理生化检测手段，获得量化的菌丝体代谢数据，以此来评价菌种活力的一种方式［5］。“自由基理论”（FRTA）是近年来各种生物系统中老化研究的主要理论之一，当自由基产生过多时，会出现细胞损伤、器官衰老甚至生物体老化等状况［6］。李敏等［7］研究发现，超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量等可作为菌丝体活力的评价指标。许修宏等［8］研究添加物对木耳液体菌种老化的影响中发现，黑木耳SOD、过氧化物酶（POD）等活性也与菌丝老化密切相关。在食用菌研究领域，前人研究发现，胞外酶类分泌和菌龄存在相关关系，王云灵［9］研究发现，纤维素酶和蛋白酶活性与菌龄呈显著负相关，多酚氧化酶与菌龄呈极显著正相关性。陈军等［10］研究发现，纤维素酶已经成为菌种活力强弱的检验指标。

因此，笔者测定了老化过程中黑木耳菌丝体的生理酶，研究生理酶与胞外酶存在的相关性，以期探究黑木耳菌丝在老化过程中的生理反应，为黑木耳老化研究奠定理论依据。

1  材料与方法

1.1  试验菌株

为实验室保藏的黑木耳菌株。

1.2  试验处理

培养基配方为PDA培养基40 g，酵母粉3 g定容至1 L水中，高压灭菌后分装至9 mm玻璃培养皿中，老化处理培养皿中每皿加入20 mL基质。将活化的黑木耳菌种接种至老化处理培养皿中，放置23 ℃下培养，待菌丝长满培养皿即开始取样（CK），以后每隔10 d取样1次，取样后将培养皿放置在-80 ℃冰箱保藏备用。

1.3  生理酶测定

取样8次（分别为处理①（CK）、处理②～⑧）后菌丝体发生大量自溶，以后不再取样。将培养皿从-80 ℃依次通过-20、0 ℃解冻，取1/4培养皿中培养基放置在装有100 mL灭菌水的无菌三角瓶中，放置在振荡摇床中（80 r/min）4 h，取上清液测定抗氧化生理酶。抗氧化生理酶含量采用试剂盒测定（苏州格锐思生物科技有限公司）。

1.4  数据处理

采用Excel 2010和SPSS 18.0进行数据分析。

2  结果与分析

2.1  老化过程中生理酶变化情况

从图1可以看出，黑木耳菌丝体在老化过程中菌丝体抗氧化生理酶的变化趋势各不相同，其中POD、SOD和过氧化氢酶（CAT）变化趋势基本一致，呈先上升后下降的趋势，POD最高值在处理⑥，处理④、处理⑤、处理⑥之间差异不显著（P>0.05），高于其他处理；SOD最高值在处理⑤，处理④、处理⑤、处理⑥、处理⑦间差异不显著（P>0.05），显著高于其他处理（P<0.05）；CAT最高值在处理⑥，且与处理⑦间差异不显著（P>0.05），显著高于CK、处理②、处理③、处理④（P<0.05），CK、处理②、处理③、处理④、处理⑤、处理⑧之间差异不显著（P>0.05）。多酚氧化酶（PPO）呈快速下降趋势，CK显著高于其他（P<0.05），处理③、处理④、处理⑤、处理⑥、处理⑦、处理⑧间差异不显著（P>0.05）。

2.2  老化過程中MDA、脯氨酸（Pro）变化情况

从图2可以看出，老化过程中菌丝体MDA和Pro含量均呈下降趋势，MDA含量CK、处理②、处理③、处理④、处理⑤间差异不显著（P>0.05），后续处理快速下降；Pro含量CK显著高于其他处理（P<0.05），处理③、处理④、处理⑤、处理⑥、处理⑦、处理⑧间差异不显著（P>0.05）。

2.3  生理酶与胞外酶相关性分析

进一步对老化过程中黑木耳菌丝体生理酶与滤纸酶、半纤维素酶、纤维素酶、漆酶、淀粉酶、果胶酶、纤维二糖酶7种胞外酶进行相关性分析，发现老化过程中PPO与5种胞外酶呈极显著正相关（P<0.01），与淀粉酶和纤维二糖酶不存在相关性。CAT与纤维素酶呈极显著负相关（P<0.01），与半纤维素酶、漆酶、淀粉酶呈显著负相关（P<0.05）。SOD与纤维素酶呈极显著负相关（P<0.01），与纤维二糖酶呈极显著正相关（P<0.01），与滤纸酶呈显著负相关（P<0.05）。POD与纤维二糖酶呈极显著正相关（P<0.01）。MDA与半纤维素酶、纤维素酶、漆酶、淀粉酶呈极显著正相关（P<0.01），与果胶酶、纤维二糖酶呈显著正相关（P<0.05）。Pro与滤纸酶、半纤维素酶、纤维素酶、漆酶、果胶酶呈极显著正相关（P<0.01），与淀粉酶呈显著正相关（P<0.05）（表1）。

3  讨论

SOD是抗氧化酶的第一道防线［11］，CAT在所有酶中清除活性氧效率最高［12］，上述酶活性下降会导致菌丝细胞内活性氧的快速积累。测定发现，黑木耳抗氧化酶SOD从第45天开始上升，105 d开始下降，CAT从第60天开始上升，105  d开始下降，表明105 d后黑木耳菌丝的活性氧快速积累。这与朱海峰［13］研究结果相印证，即黑木耳菌丝老化过程中自由基产生也在呈上升趋势。表明黑木耳菌丝老化与其他植物等老化情况相似［14-15］，也存在着“自由基理论”。该研究结果发现，MDA、Pro含量呈下降趋势，这与前人研究结果不同［13］。MDA是膜脂过氧化的产物之一［16］，Pro在一定程度上衡量膜稳定性［17］。该研究结果发现，MDA、Pro呈下降趋势，这与前人研究结果不同［13］，其原因有待进一步分析。

通过进一步分析发现，抗氧化酶系统、MDA、Pro与胞外酶之间存在很高的相关性。表明抗氧化酶系统与胞外酶系统存在内容联系，这部分未查到相关文献，现有证据表明活性氧［18］、CAT［19］参与调节植物生长和发育。这可能是由于随着培养时间延长，培养基中的活性氧、CAT等积累，从而影响到胞外酶的分泌；或者是由于随着培养时间的延长，菌丝胞外酶难获取更多的营养物质，从而导致抗氧化酶的功能启动，这有待进一步进行研究。

参考文献

［1］戴浩，何颖，杜顺刚.对菌种市场存在问题的调查与建议［J］.中国食用菌，2010，29（1）：62-63.

［2］刘伟，何培新，蔡英丽，等.羊肚菌衰老特性的测定分析［J］.食药用菌，2021，29（1）：44-49.

［3］袁立，许修宏.木耳菌丝老化过程的微形态学研究［J］.菌物学报，2011，30（4）：566-571.

［4］王博，许修宏，袁立.双孢蘑菇营养菌丝老化现象的形态学研究［J］.东北农业大学学报，2011，42（5）：99-103.

［5］方亮.暗褐网柄牛肝菌菌丝体衰老相关生理特性及代谢组学分析［D］.南宁：广西大学，2022.

［6］丁秋英.金福菇多糖抗衰老作用研究［D］.合肥：安徽大学，2016.

［7］李敏，闫伟.褐环乳牛肝菌在液体摇瓶培养过程中菌丝体活力指标的筛选研究［J］.华北农学报，2007，25（5）：176-179.

［8］许修宏，盛思远，朱海峰，等.添加物对木耳液体菌种老化的影响［J］.东北农业大学学报，2019，50（9）：19-27.

［9］王云灵.鸡腿菇菌种质量检测技术研究［D］.福州：福建农林大学，2010.

［10］陈军，王雨净，夏志华.几种珍稀食用菌菌种纤维素酶系组分活性的比较［J］.上海师范大学学报（自然科学版），2006，35（6）：76-80.

［11］IGHODARO O M，AKINLOYE O A.First line defence antioxidants.superoxide dismutase（SOD），catalase（CAT）and glutathione peroxidase（GPX）：Their fundamental role in the entire antioxidant defence grid［J］.Alex J Med，2017，54（4）：287-293.

［12］GILL S S，TUTEJA N.Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress  tolerance in crop plants［J］.Plant Physiol Biochem，2010，48（12）：909-930.

［13］朱海峰.黑木耳液体菌种老化评价指标的研究［D］.哈尔滨：东北农业大学，2021.

［14］韩沛霖，李月明，刘梓毫，等.植物种子老化的生理学研究进展［J］.生物工程学报，2022，38（1）：77-88.

［15］刘娟，归静，高伟，等.种子老化的生理生化与分子機理研究进展［J］.生态学报，2016，36（16）：4997-5006.

［16］赵娟，尹艺臻，王晓璐，等.不同品种谷子愈伤组织对拿捕净胁迫的生理响应［J］.中国农业科学，2020，53（5）：917-928.

［17］徐亚军，赵龙飞，邢鸿福，等.内生细菌对盐胁迫下小麦幼苗脯氨酸和丙二醛的影响［J］.生态学报，2020，40（11）：3726-3737.

［18］庞杰，郝丽珍，张凤兰，等.沙芥叶片活性氧和抗坏血酸对干旱胁迫的响应［J］.植物生理学报，2013，49（1）：57-62.

［19］王丽宁.糙皮侧耳过氧化氢酶基因特征分析和功能研究［D］.北京：中国农业科学院，2019.