甜菜单胚雄性不育系NM3005A 及保持系NM3005B 的选育

付增娟 王 良 赵尚敏 鄂圆圆 张自强 李晓东 张必周白 晨 郑文哲 索宁宁 周晓华 孙梦媛 张惠忠 张 辉

（1.内蒙古自治区农牧业科学院特色作物研究所/内蒙古自治区甜菜品种遗传改良与种质创制重点实验室 内蒙古呼和浩特 010031；2.赤峰市巴林左旗农牧技术推广中心 内蒙古赤峰 024000）

甜菜是世界上最重要的两大糖料作物之一，选育性状优良、抗病、适宜机械化作业、单胚率高、雄性不育的种质及单胚雄性不育杂交种是现代甜菜育种的主攻方向和主导趋势。 利用核质互作型雄性不育系与授粉系间进行杂交获得最大程度的杂种优势以提高甜菜的产量水平和品质水平， 而单胚种的特性既能满足种子丸粒化的加工需求， 利于机械化作业实施，又能减少劳动用工，同时也是推广甜菜纸筒育苗、精量播种、节水灌溉、机械化管理等配套综合栽培设施的基础， 因而单胚雄性不育杂交种可使甜菜综合经济效益得以提升[1]。

细胞质雄性不育（CMS）是植物普遍存在的一种现象，在生产应用与基础研究中具有显著优势，成为科学研究的热点。甜菜细胞质雄性不育（CMS）选育是当代甜菜育种的核心技术[2]，作为甜菜杂交种最主要的骨干亲本材料， 其选育进程直接决定了甜菜新品种的创制。 欧美国家早已不使用产量偏低的甜菜多胚品种， 利用单胚雄性不育的高产优质型品种是当今世界甜菜育种的主流， 也是我国甜菜育种的主攻目标。 利用单胚雄性不育系配制杂交种的优点是制种省力、杂交率高、原种可控、杂种高产、单胚种子便于机械化精量点播和纸筒育苗移栽[3]。 如何快速准确选育出优异亲本材料配制出优良杂交组合是新品种选育的关键。 甜菜属于二年生异花授粉作物，种质资源鉴选、亲本材料选育、杂交组合配制等各环节选育进程均较其他一年生作物繁复， 尤其对于核心亲本甜菜单胚雄性不育系选育更为复杂， 一年生营养生长阶段的农艺性状、 二年生生殖生长阶段的农艺性状、 配合力高低等诸多性状均需依据育种目标审慎考虑。 本文作者对甜菜单胚雄性不育系NM3005A 选育过程中的主要育性、 胚数性、 配合力、 抗丛根病性、 细胞质类型、 花药和花粉表型等重要性状进行了阐述。

1 亲本来源

甜菜单胚雄性不育系NM3005A 是内蒙古农牧业科学院甜菜育种创新团队2013 年6 月以从多胚授粉系HBB-1 繁殖田中发现的雄性不育株为母本，以从美国引进的单胚材料960767 和内蒙古农牧业科学院自育的抗丛根病材料N98122 杂交改良出的单胚育种材料为授粉系进行多代回交选育而成。

2 选育过程

2013 年采取人工授粉套纸袋杂交的方法， 对发现的雄性不育单株用改良创制出的单胚保持系进行杂交，收获F1种子；同年进行南育加代。

2014-2020 年采用成对套袋方法进行回交选育，不育系NM3005A 在育性表型鉴定中， 完全不育型和半不育Ⅰ型不育株率由61.90%提升至98.00%（表1）；在胚数性表型鉴定中， 单胚率由最初的0 提升至98.00%（表2），期间根据育种目标对其产量性状、品质性状、抗病性等进行选择，收获BC1F1～BC4F1代种子。

表1 单胚雄性不育系NM3005A 选育育性表现

表2 单胚雄性不育系NM3005A 选育胚数性表现

2021-2022 年进行产量、品质、抗丛根病性、配合力等试验鉴定。在2 年的产量、品质水平鉴定中，甜菜单胚雄性不育系NM 3005A的平均产量62 460.00 kg/hm2，平均含糖率15.80%，平均产糖量9 868.68 kg/hm2，产糖量较对照杂交品种KWS1197 （CK） 降低19.74%；甜菜单胚雄性不育保持系NM3005B 平均产量55 920.00 kg/hm2，平均含糖率15.51%，平均产糖量8 673.19 kg/hm2， 产糖量较对照杂交品种KWS1197降低29.46%（表3）。

表3 NM3005A 及NM3005B 的产量、品质鉴定结果

抗丛根病性鉴定试验在内蒙古农牧业科学院甜菜丛根病病圃中进行，甜菜单胚雄性不育系NM3005A丛根病病情指数为25， 单胚雄性不育保持系NM3005B 丛根病病情指数为28，为中抗抗丛根病类型，丛根病病情指数较对照杂交品种（CK）分别降低4 和1，表现出较强的抗性（表4）。

采用不完全双列杂交法进行配合力测定， 以自育多胚种品系NR-Z1、N98122、N98122×NR-Z1、HBI-1、NR-Z3-3 为测验种， 对NM3005A 等5 个单胚雄性不育系进行根产量配合力测定。 结果表明，单胚雄性不育系NM3005A 根产量一般，配合力（GCA）为最高，一般配合力效应值为1.47，表现出较高的一般配合力（表5）。

表5 单胚雄性不育系NM3005A 根产量一般配合力测定

3 成系鉴定

3.1 育性和单胚性表型鉴定

不育系NM3005A 及保持系NM3005B 二年生生殖生长阶段育性、胚数性鉴定试验于2023 年4 月在内蒙古呼和浩特市和林格尔县单胚雄性不育系成系鉴定圃进行，成系鉴定不育系及保持系按1∶1 比例分行栽植，每个材料栽植100 株，株行距40 cm×60 cm。在甜菜盛花期， 由内蒙古自治区农牧业科学院组织， 聘请哈尔滨工业大学、 内蒙古科学技术研究院等国内甜菜专家组成鉴定组， 对内蒙古农牧业科学院特色作物研究所选育出的甜菜单胚雄性不育系NM3005A 及保持系NM3005B 进行了田间育性和单胚性表型现场鉴定。

3.1.1 单胚雄性不育系 NM3005A 鉴定结果鉴定株数87 株，其中完全不育株86 株，半不育Ⅰ型1 株，完全雄性不育率为98.85%； 单胚株87 株， 单胚株率100%。

3.1.2 单胚雄性不育保持系 NM3005B 鉴定结果鉴定株数83 株， 其中不育株0 株， 可育株率为100%；单胚株83 株，单胚株率100%。

3.2 分子细胞质类型鉴定

利用F.V.Owen 型甜菜细胞质类型快速鉴定技术， 采用已开发的TR1 引物进行PCR 扩增，对NM3005A 及NM3005B 细胞质类型进行鉴定。

3.2.1 TR1 引物系列 TR1：

5'-AGAACTTCGATAGGCGAGAGG-3'

5'-GCAATTTTCAGGGCATGAACC-3'

3.2.2 DNA 提取与检测 在成系鉴定圃中分别随机选取NM3005A 及NM3005B 植株各20 株，将甜菜生长期新鲜幼嫩叶片单株取样装入PE 管中，置入液氮罐带回实验室，利用植物基因组DNA 提取试剂盒提取甜菜叶片DNA 并进行DNA 质量检测。

3.2.3 PCR 反应体系及PCR 程序 甜菜细胞质基因型鉴定PCR 反应体系首先用ddH2O 将DNA 样品稀释到40～50 ng/μL，反应体系25 μL，其中DNA 模板1 μL、 上下游TR1 引物各1 μL、MIX 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL。PCR 程序为94℃预变性5 min，95℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min， 共30 个循环；72℃进一步延伸10 min，4℃+∞；4℃保存。 电泳检测用PCR 产物5 μL， 使用1%琼脂糖凝胶在1×TAE电泳缓冲液中电泳，电泳电压120 V，电泳时长30 min。用凝胶成像系统紫外光下检测电泳结果。

3.2.4 结果分析 PCR 电泳结果显示， 单胚雄性不育系NM3005A 的细胞质类型为S 型， 单胚雄性不育保持系NM3005B 的细胞质类型为N2 型。 由图1可知， 泳道M 为DL 100 Marker， 泳道1 ～10 为NM3005A，条带位置在450 bp，细胞质类型为S 型；泳道11～20 为NM3005B，条带位置在530 bp，细胞质类型为N2 型。

图1 部分NM 3005A、NM 3005B 材料PCR 电脉检测结果

3.3 电子显微镜花药及花粉粒检测鉴定

利用扫描电子显微镜对NM3005A 及NM3005B进行花药及花粉粒检测鉴定。

3.3.1 取样和固定 选取NM3005A 及NM3005B 采种株开花前未开放的花蕾， 用生理盐水清洗试样表面， 将清洗后的试样放入由0.1 mmol/L 磷酸盐缓冲液配制的2%～3%戊二醛固定液中进行前固定，4℃下前固定2 h 以上。经戊二醛固定的生物试样用与前固定相同的缓冲液充分漂洗后， 加入相同缓冲液配制的1%四氧化锇固定液，4℃下固定1～2 h。

3.3.2 脱水和置换 采用浓度分别为50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇进行梯度脱水， 每级浓度脱水5～15 min。 吸弃100%脱水剂，转入醋酸异戊酯与脱水剂1∶1 的混合液中置换10～20 min， 并适当摇动，再转入纯醋酸异戊酯中充分置换。

3.3.3 干燥和粘样 脱水后的生物试样选用临界点干燥法进行干燥。 粘样采用导电双面胶带将试样粘接在扫描电镜样品台上，使试样观察面朝上。

3.3.4 表面导电处理 采用离子溅射法对干燥后的生物试样表面喷镀一层导电镀层。

3.3.5 电镜扫描 开启扫描电镜， 待真空度达到仪器规定的高真空指标后进行观察前的仪器检查，对中电子束，消除图像的像散。 关闭电子枪发射后对样品室放气，按要求将试样装入样品室，重新抽真空。根据生物试样的观察要求，设置扫描电镜观察条件。打开电子枪束流，选择需要的信号检测器，获得二次电子扫描图像或背散射电子扫描图像。 根据观察需要选择合适的放大倍率，进行图像聚焦、消像散、亮度和反差调节等操作。 对目标区域生物试样形态结构进行图像记录。

3.3.6 电镜扫描图像结果 对不育系及其保持系的花药、花粉的生物学特性进行比较观察。 结果表明，甜菜单胚雄性不育系NM3005A 及保持系NM3005B的花药和花粉在形态与细胞上存在明显差异。 不育系NM3005A 花药发育不正常， 形状不规则且干瘪；花粉粒为不规则类球形，表面粘稠且不光滑，花粉败育。 保持系NM3005B 花药发育正常，形状规则且药室饱满；花粉粒为圆球形，表面光滑，萌发孔清晰可见（图2～图5）。

图2 不育系花药

图3 不育系花粉

图4 保持系花药

图5 保持系花粉

4 结语

雄性不育在植物中较为常见。 植物雄性不育表现特征为雌蕊发育正常而雄蕊败育， 但雌蕊能够接受外来花粉授粉从而达到授精目的[4]。 有研究表明，已经在140 多种植物中观察到了植物雄性不育特征， 并且细胞质雄性不育的发生与线粒体基因组突变有着密切的关系[5-6]，如农作物水稻[7]、烟草[8]、玉米[9]等中都有雄性不育现象。 也正是因为雄性不育系的存在， 在很大程度上促进了杂种优势在农作物中的应用，从而使得作物高产、稳产[10-11]。

甜菜的雄性不育系分为核不育型和质核互作型2 种。 核不育型是受一对隐性基因（aa）控制，而质核互作型其育性由细胞质基因S、N 和细胞核基因X、Z基因的相互作用决定的[12]，当细胞质为S 型，细胞核基因型为xxzz 时， 则为不育系； 细胞质为N 型细胞核为xxzz 时，则为保持系[13]。通过对Owen 型不育系（S 型）和正常可育系（N 型）线粒体的测序结果分析， 发现N 型具有S 型所没有的4 个开放读码框（ORF）。 显然，这4 个ORF 相关基因很可能与细胞质雄性不育相关， 所以推测CMS 是一种功能获取而不是功能缺失的突变[14]。

甜菜质核互作基因型不育系是目前唯一用于世界范围生产甜菜杂交种的雄性不育系[15]，作为生产一代杂种的理想亲本品系， 其选育及应用研究一直是育种工作者研究的热点。 甜菜杂种优势利用关键在于选育甜菜不育系技术， 而选育不育系的关键在于选育甜菜保持系[16]。 杂交种具有较强的杂种优势，因此甜菜雄性不育系及保持系的选育在现代甜菜育种中至关重要，能为解决甜菜种子“卡脖子”问题、打好种业翻身仗奠定坚实基础。