冠心舒通胶囊中的药效成分采用超高效液相色谱-串联质谱法检测的可行性

范 洋

冠心舒通胶囊被2020 年版《中华人民共和国药典》一部收录，是以蒙医药理论为指导，由天竺黄、丹参、丁香、广枣以及冰片5 味中药材配伍并经现代工艺加工研制而成的中药复方制剂品种[1]。冠心舒通胶囊在临床上主用于治疗胸痹心血瘀阻证等病证，具有通经活络、活血祛瘀、行气止痛之功效，适用于胸痛、气短、胸闷、心慌等临床症状，疗效确切，效果显著[2-3]。药效成分在患者体内的分布特征以及含量变化与药物的药理效应密切相关[4]。有研究表示，冠心舒通胶囊中含有能够调节免疫力，保护血管、心肌，调节血脂等重要作用的成分，如丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、隐丹参酮等脂溶性的二萜醌类化合物，丹参素、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A 等水溶性的酚酸类化合物以及熊果酸等三萜类化合物，这是其发挥临床疗效的物质基础[5]。药代动力学反映药物在患者体内吸收、代谢、分布以及排泄规律，对于药物的临床应用指导，以及疗效发挥具有重要作用[6]。因此阐明冠心舒通胶囊中的主要药效成分，对相关成分进行定量研究，不但有助于提高其药物稳定性以及质量标准，还能够对疾病模型体内的药代动力学特征进行研究。目前，在分析复杂的中药成分及其体内代谢物研究中超高效液相色谱-串联质谱（ultra performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry, UPLC-MSMS）法具有独特优势，是进行药代动力学分析的有力手段[7]。但目前临床上关于UPLC-MSMS 法检测分析冠心舒通胶囊中丹参素、咖啡酸、原儿茶醛、原儿茶酸、迷迭香酸、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹酚酸A、丹酚酸B 和熊果酸等药效成分的临床研究仍然罕见。基于此，本研究就采用UPLC-MSMS 法检测分析冠心舒通胶囊中丹参素、咖啡酸、原儿茶醛、原儿茶酸、迷迭香酸、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹酚酸A、丹酚酸B 和熊果酸等药效成分的可行性进行分析。现报道如下。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Xevo TQD 三重四极杆质谱仪（美国Waters 公司）；Thermo Vanquish 超高效液相色谱仪、ST8R 型高速冷冻离心机、Thermo Hypersi1 GOLD C18色谱柱（2.1 mm×50 mm×1.8 μm）（美国Thermo 公司产品）；XS205DU 十万分之一天平（瑞士Mettler Toledo上海仪器有限公司）；HHS 数显恒温水浴锅（江苏金坛市医疗仪器厂）；SYU-80-2000DT 超声波清洗机（郑州生元仪器有限公司）；娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；MTN-2800D 氮吹仪（Autoscience 仪器公司）。

1.2 样品与试剂

对照品咖啡酸（110885-201703）、丹参素（110855-201915）、原儿茶醛（110810-202210）、原儿茶酸（110809-202207）、迷迭香酸（111871-202007）、丹参酮Ⅰ（110867-201607）、丹参酮ⅡA（110766-202323）、隐丹参酮（110852-201807）、丹酚酸A（111573-202106）、熊果酸（110742-201823）、丹酚酸B（111562-202318）（中国食品药品检定研究院，含量质量分数均＞97%）。水为超纯水，甲醇、甲酸、乙腈均为色谱纯（美国Fisher 公司），其他试剂均为分析纯。冠心舒通胶囊共6 个批次（批号：220503、230211、230406、220611、230703、210601，依次将编号设为A1、A2、A3、A4、A5、A6，陕西步长制药有限公司，国药准字Z20020055）。

2 方法与结果

2.1 色谱与质谱条件

Acquity UPLC BEH C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）；梯度洗脱；洗脱程序：0～2 min、2～3 min、3～7 min依次为25%～60%A、5%～25%A、60%～90%A；进样量：5 μl；流速：0.2 ml/min；柱温：40 ℃。电喷雾离子源（ESI），喷雾电压为3.5 kV，离子源温度为150 ℃，采用选择离子扫描（SIR）和多反应检测扫描（MRM）模式，脱溶剂气（流速为650 L/h，温度为350 ℃），辅助气为氮气，碰撞气（氩气）压力为2.85 Pa，锥孔气流速为50 L/h。其他参数见表1。

表1 质谱参数

2.2 溶液制备

2.2.1 供试溶液 精密称定冠心舒通胶囊内容物1.00 g，置于锥形瓶中，精密加入甲醇溶液20 ml（体积分数50%），密封后称定质量，超声处理0.5 h，冷却后称定质量，甲醇溶液（体积分数50%）补足减失的质量后滤过，再经0.22 μm 微孔滤膜过滤。

2.2.2 对照溶液制备 取11 种药品成分的对照品精密称定，与体积分数50%甲醇溶液分别配制成质量浓度约为0.5 g/L 的单一对照储备液。精密量取单一对照储备液适量，分别加入体积分数50%甲醇溶液配制成质量浓度为100.0 mg/L 的丹参素、质量浓度为10.0 mg/L 的咖啡酸、质量浓度为90.0 mg/L的迷迭香酸、质量浓度为30.0 mg/L 的原儿茶醛、质量浓度为450.0 mg/L 的原儿茶酸、质量浓度为100.0 mg/L 的丹酚酸A、质量浓度为1.0 g/L 的丹酚酸B、质量浓度为250.0 mg/L 的隐丹参酮、质量浓度为0.1 g/L 的丹参酮Ⅰ、质量浓度为90.0 mg/L 的丹参酮ⅡA、质量浓度为30.0 mg/L 的熊果酸的混合对照储备液。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性和范围 精密量取混合对照储备液，甲醇溶液（体积分数50%）稀释并定容，配制成6 个质量浓度的系列标准溶液，见表2。进行色谱质谱分析，以峰面积为纵坐标，以各成分质量浓度（mg/L）为横坐标，进行线性回归，标准曲线方程及相关系数采用Masslynx 4.1 系统软件进行关系数计算。以信噪比S/N=10 计算定量限（LOQ），信噪比S/N=3 计算检测限（LOD），结果见表3。

表2 不同成分不同质量浓度标准溶液(g/L)

表3 各成分化合物的回归方程、线性范围、相关系数、LOD 以及LOQ 结果

2.3.2 稳定性、精密度以及重复试验 取同一混合对照溶液以及实验溶液（A1），分别于0、4、8、12、16、24 h 进样分析，计算相应相对标准偏差（RSD）。取中质量浓度的混合对照溶液，连续进样6 次及连续进样3 d（每天重复进样6 次），计算相应RSD。取A5 批次的冠心舒通胶囊内容物6 份，按“2.2.1”中方法制备供试溶液，并进行含量测定。所有RSD均≤3%，提示仪器精密度较高，24 h 内稳定性较高，重复性良好。见表4。

表4 各化合物的稳定性、精密度及重复性考察结果(RSD,%)

2.3.3 加样回收率试验 取9 份A6 次冠心舒通胶囊样品，每份1.0 g，精密称定后加入冠心舒通胶囊相应成分量的80%、100%和120%，配制低、中、高3 种质量浓度的对照混合溶液。按“2.2.1”平行制备供试溶液，并测定含量。结果显示各成分平均回收率在98%～100%，RSD 均小于3%，提示该方法检测所有成分的准确度较高。见表5。

表5 加样回收率

2.4 样品含量测定与质量评价

取不同批次冠心舒通胶囊样本6 份，按“2.2.1”的方法平行制备供试溶液，“2.1”色谱质谱条件进样分析，记录色谱峰面积，计算冠心舒通胶囊中各成分的含量，结果显示不同批次之间各成分含量RSD均小于9%。采用SIMCA 14.0 多元数据处理软件进行数据分析，分析不同批次之间冠心舒通胶囊的质量稳定性。结果显示不同药物批次的质量偏差均控制在标准偏差左右，表明批次之间差异较小，但A5批次的质量偏差略大于2 std，与其他批次稍有差异。见表6。通过载荷分析可知原儿茶酸是导致A5 批次质量差异的主要因素，提示在以后的生产及质控中需进行重点控制。

表6 不同批次冠心舒通胶囊中各成分的含量

3 讨论

冠心舒通胶囊是在5 味天然植物药材配伍基础上经由现代工艺加工制成的中药复方制剂，临床广泛用于冠状动脉粥样硬化性心脏病心绞痛等疾病的治疗，与西医常规治疗此类疾病的药物如抗血栓药物、β 受体阻滞药、抗血小板药物、有机硝酸盐等药物比较，能够避免血压和心率降低、血栓以及血流动力学变化等[8-9]。但目前临床上对于冠心舒通胶囊中含有的有关成分的临床研究仍然罕见，且不够清晰。黄小婧等[10]的研究表示，通过UPLC-MSMS 法检测冠心苏合制剂10 种非法添加色素的质量评价参考价值较高。为此作者采用UPLC-MSMS 法检测分析冠心舒通胶囊中相关药效成分。

实验中作者进行了色谱优化：通过设置不同比例与类型的流动相，分析对比不同流动相中各个成分的分离效果，选择最优流动相进行分析。结果表明，在流动相梯度洗脱时采用乙腈-体积分数0.1%甲酸水，分离效果最佳，色谱峰形好，利于冠心舒通胶囊中不同成分的检测分析。为使所有成分均具有良好的溶解性，实验考察了不同浓度甲醇、不同超声时间及溶剂效应对提取成分的影响。结果显示，超声提取30 min，甲醇溶液体积分数为50%作为提取条件时，各成分的响应较优，无重复析出现象。选择UPLC-MSMS 进行多组分含量同时测定，在优化过程中研究采用了正负离子结合多模式检测，最终丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、隐丹参酮采用正离子模式，其他成分采用负离子模式，除熊果酸以外的其他成分采用MRM 检测，熊果酸采用SIR 检测。同时测定结果显示，不同批次的冠心舒通胶囊中的活性成分含量差异较小，RSD 均在10%以内。含量测定分析表明不同批次的冠心舒通胶囊总体质量较为稳定，偏差＜2 std，但亦存在批次之间的微小差异，应对原儿茶酸含量进行更加精细的控制，与左莉华等[11]的研究相似。

综上所述，采用UPLC-MSMS 法检测分析冠心舒通胶囊中，丹参素、咖啡酸、原儿茶醛、原儿茶酸、迷迭香酸、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹酚酸A、丹酚酸B 和熊果酸等药效成分在不同批次中质量稳定，且检测稳定性、精密度均较高，能够从整体上综合评价药物质量，利于此药品的质量控制。