气相色谱-质谱联用法用于测定盐酸普罗帕酮原料药中基因毒性杂质环氧氯丙烷的可行性

付金凤 蒋晓勤

盐酸普罗帕酮为广谱抗心律失常药物，通过降低动作电位升高速率而减慢冲动传导，可延长心房和房室结及心室的不应期，用于治疗室性心律失常、心动过速以及心房纤颤等[1-2]。盐酸普罗帕酮的合成工艺众多，但大多以环氧氯丙烷作为主要原料[3]。环氧氯丙烷的环氧结构为警示结构，是潜在基因毒性杂质[4-6]。2017 年10 月27 日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单中将环氧氯丙烷分类为2A 类致癌物。因此，对盐酸普罗帕酮中环氧氯丙烷残留量进行控制显得尤为重要。目前，常用的环氧氯丙烷检测方式有离子色谱法（IC）、气相色谱法（GC）和气相色谱-质谱联用法（GC-MS）[7-10]。其中，GC-MS 因其灵敏度高、抗干扰能力强，现已被广泛应用于药物、饮用水以及化工原料中环氧氯丙烷的检测[11-12]。本研究就GC-MS 测定盐酸普罗帕酮原料药中基因毒性杂质环氧氯丙烷的可行性进行分析。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

GCMS-TQ8040NX 三重四级杆型气相色谱质谱联用仪（Shimadzu）；XPE205 电子天平（Mettler Toledo）。

1.2 试药

盐酸普罗帕酮（生产企业：A，批号：01211206C）；环氧氯丙烷（Aladdin，批号：E108181，质量分数：99.5%）；实验用水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：VF-624 ms（Agilent，30 m×0.25 mm，1.4 μm）；柱温：程序升温法，起始温度40 ℃，维持2 min，再以10 ℃/min 的速率升温至120 ℃，然后以30 ℃/min 的速率升温至250 ℃，维持3 min；载气类型：高纯氦气；载气流速：1.5 ml/min；进样量：1.0 ml；分流比：5∶1；平衡时间：30 min；进样方式：顶空进样；平衡温度：80 ℃。

质谱条件：离子源温度：230 ℃；接口温度：260 ℃；电离源：电子轰击离子化（EI）；检测器电压：0.2 kv；选择性离子模式（SIM）检测，环氧氯丙烷特征离子质荷比（m/z）为49、57、62。见图1。选择响应最强的m/z 57 作为定量离子。

图1 环氧氯丙烷特征离子

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品储备液 精密称取环氧氯丙烷32 mg，置100 ml 量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，再精密量取上述溶液1 ml，移至100 ml 量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，制成每毫升含环氧氯丙烷3.2 μg 的溶液。

2.2.2 对照品溶液a 精密量取2.2.1 项下制备的对照品储备液1 ml，置于100 ml 量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，制成每毫升含环氧氯丙烷32 ng 的溶液。

2.2.3 灵敏度溶液 精密量取2.2.2 项下制备的对照品溶液a 5 ml，置于50 ml 量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，制成每毫升含环氧氯丙烷3.2 ng 的溶液，精密量取5 ml，置20 ml 顶空瓶中，压盖密封。

2.2.4 供试品溶液 取盐酸普罗帕酮原料药约50 mg，精密称定，置于20 ml 顶空瓶中，精密加入水5 ml，压盖密封，摇匀。

2.3 方法学验证

2.3.1 标准曲线 分别取2.2.1 项下制备的对照品储备液0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 和4.0 ml 置于6个100 ml 量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为系列对照品溶液。再依次精密量取上述各溶液5 ml，分别置于20 ml 顶空瓶中，压盖密封。进样分析，以环氧氯丙烷浓度（ng/ml）为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，拟合曲线为y=867.08x+542.19，r=0.999 8。结果表明，环氧氯丙烷在4～128 ng/ml内线性关系良好。

2.3.2 检出限和定量限 精密量取2.2.3 项下灵敏度溶液，稀释3 倍作为定量限溶液，稀释8 倍作为检测限溶液。结果：定量限溶液信噪比为27.2，浓度为1.1 ng/ml；检测限溶液信噪比为8.9，浓度为0.4 ng/ml。

2.3.3 精密度 精密量取2.2.2 项下制备的对照品溶液a 5 ml，置于20 ml 顶空瓶中，立即压盖密封，平行制备6 份，进样分析，记录色谱图，计算环氧氯丙烷色谱峰保留时间与峰面积的相对标准偏差（RSD）值，结果分别为0.03%和1.9%，表明该方法仪器精密度良好。

2.3.4 加样回收率 精密量取5 ml 低（16 ng/ml）、中（32 ng/ml）、高（64 ng/ml）浓度溶液，分别置于装有50 mg 样品的20 ml 顶空瓶中，立即压盖密封，各浓度平行制备3 份。见表1。

表1 环氧氯丙烷加样回收率实验结果

2.4 样品测定

样品中未检出环氧氯丙烷。见图2。结果表明，环氧氯丙烷含量符合规定（标准规定：环氧氯丙烷不得超过3.2 ppm）。

图2 典型GC-MS/MS 色谱

3 讨论

3.1 溶剂的选择

本研究分别选用甲醇、水、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜作为溶剂进行实验，环氧氯丙烷响应为：二甲亚砜＞N,N-二甲基甲酰胺＞水＞甲醇，但以二甲亚砜和N,N-二甲基甲酰胺为溶剂时，背景干扰较大，且有机试剂毒性较大，环境污染性强，因此最终选择水作为溶剂，由于盐酸普罗帕酮极微溶于水，因此基本不影响环氧氯丙烷的测定。

3.2 进样方式的选择

实验中选择同一浓度对照品溶液，分别采用直接进样和顶空进样进行分析，顶空进样响应明显高于直接进样。顶空进样前处理简单，可以减少待测物在萃取或浸提中的损失，且进样量大，可相应增加响应，提高检测灵敏度，同时可以避免试剂对色谱系统带来的干扰和污染，延长色谱柱寿命[13]。

3.3 平衡条件的选择

实验中选择32 ng/ml 的对照品溶液，在70、80、90 ℃平衡温度下，分别孵育10 min、20 min、30 min、40 min，观察峰面积的变化，结果显示随着孵育温度的升高，峰面积逐渐增大。但因实验中采用水作为溶剂，顶空平衡温度接近其沸点时存在因内部气体压力过大而发生爆炸的危险[14]，因此最终选择80 ℃作为顶空孵育温度；同时，随着孵育时间的增加，环氧氯丙烷的峰面积也逐渐增大，但当超过30 min时，峰面积变化明显变缓，说明平衡时间达到30 min时，已基本实现气液平衡。为提升工作效率，实验中选择30 min 作为最佳平衡时间。

3.4 结论

本实验建立了盐酸普罗帕酮中环氧氯丙烷的检测方法，定量限为1.1 ng/ml，可满足该原料药中基因毒性杂质质控限度的要求。经各项实验验证表明，该方法操作简便、专属性强、灵敏度高、重复性好，且操作过程中不使用有机试剂，安全环保，适用于盐酸普罗帕酮原料药中环氧氯丙烷的分析，也可为盐酸普罗帕酮制剂中环氧氯丙烷的检测提供参考。