联合化疗的黄芪抗肿瘤给药时间点的筛选

邓晓霞 李清宋 李 影 刘素兰

国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer, IARC）估算的数据[1]显示，恶性肿瘤已超越心血管疾病等高死亡率慢性疾病，成为全球大多数国家和地区的第一或第二位死因。手术及放化疗是目前肿瘤最常用的治疗手段，三者常联合使用[2]，但放化疗的毒副作用较大[3-4]。

近年来，随着对中药的研究不断深入，发现了一大批抗肿瘤药物，研究其作用机制，为其临床应用提供了重要的参考。应用中草药治疗和预防肿瘤成为全世界研究的热点[5-7]。中医药以其安全、有效、低毒的特点在未来的抗肿瘤治疗领域发挥着极其重要的作用[8-9]。

黄芪，味甘，性温，归肺、肝、脾、肾经，具有补气升阳、固表止汗、托毒生津和利水消肿等功效，在临床上常作为化疗的辅助用药[10-11]。临床调研发现黄芪给药具有很大的随机性：放化疗与黄芪同时使用或放化疗后使用黄芪，临床暂未对这两种给药方式的疗效进行比较。放化疗过程中黄芪的给药时间点是否对其抗肿瘤疗效有影响尚无定论。本研究就黄芪在肿瘤的化学治疗中最佳给药时间点进行分析。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物与细胞

雄性昆明（KM）小鼠135 只，SPF 级，体重（20±2）g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2013-0004；H22 肝癌瘤株，由中药固体制剂制造技术国家工程研究中心药理学科组提供。

1.2 药物与试剂

黄芪颗粒，广东一方制药有限公司，批号：404021T；5-氟尿嘧啶（5-FU）注射液，上海旭东海普药业有限公司，批号：FA150503；0.9%氯化钠注射液，江西科伦药业有限公司，批号：D15041604-1。

1.3 仪器设备

超纯水仪，默克密理博 Milli-Q Advantage A10；十万分之一天平，梅特勒，型号：MS205DU；EVC动物饲养装置，苏州猴皇动物实验设备科技有限公司；BC-2800 全自动血细胞分析仪，深圳迈瑞有限公司；RM2255 型全自动轮转式切片机，德国徕卡显微系统有限公司；NiKon Ci-S 正置显微镜，日本尼康公司。

1.4 分组、造模及给药

1.4.1 分组 135 只小鼠适应性饲养3 d 后，称重，随机分为9 组，每组15 只，分别为正常组（C 组）、模型组（M 组）、5-FU 组（25 mg/（kg•d））、化疗同时给予黄芪高、中、低剂量组（5FU+Hh、5FU+Hm、5FU+Hl，5FU 剂量同上，黄芪5.6 g/（kg•d）、2.8 g/（kg•d）、1.4 g/（kg•d））、化疗后给予黄芪高、中、低剂量组（5-FU 后+Hh、5-FU 后+Hm、5-FU 后+Hl，5FU、黄芪剂量同上）。小鼠饲养于室温25 ℃，光照和黑暗各12 h 的标准化实验室中。

1.4.2 造模 将肝癌细胞株H22 接种于健康KM 小鼠腹腔中，待其充满腹水后无菌抽取含有H22 肝癌细胞的腹水，显微镜下调整细胞浓度为1.50×107个/ml，于小鼠右侧前肢腋窝皮下注射0.2 ml 的H22 细胞悬液。

1.4.3 给药 造模次日开始给药。第1～7 天，C 组与M 组注射0.9%氯化钠注射液，灌胃双纯水；5-FU组和化疗后给予黄芪高、中、低剂量组注射5-FU，灌胃双纯水；化疗同时给黄芪高、中、低剂量组注射5-FU，灌胃相应浓度的黄芪颗粒溶液。第8～14 天，C 组、M 组和5-FU 组灌胃双纯水，化疗同时给黄芪高、中、低剂量组和化疗后给予黄芪高、中、低剂量组灌胃相应浓度的黄芪颗粒溶液。1 次/d，连续给药14 d，每隔1 天称重1 次。造模后第3 天起，每隔1天测量肿瘤大小，肿瘤体积=1/2×a×b2，a 为长径，b 为短径。

1.5 动物处理、标本采集

实验第14 天晚上禁食不禁水，次日眼球取血，后用颈椎脱臼法处死小鼠，快速剥取肿瘤组织、胸腺组织、脾脏，肿瘤组织存放于4%多聚甲醛中。胸腺指数（脾指数）=胸腺重量（脾脏重量）/小鼠体重×100%。

1.6 HE 染色

取出已在4.2%多聚甲醛中浸泡48 h 的肿瘤组织，用低速流动的自来水冲洗36 h，经过脱水-透明-浸蜡-包埋-切片后，HE 染色，光镜下观察各组肿瘤组织的病理变化。

1.7 全血检测

将现取的血液用全自动血细胞分析仪检测各组白细胞及淋巴细胞、中性粒细胞。

1.8 数据分析

采用SPSS 21.0 统计软件进行数据分析，计量资料以±s 表示，组间比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黄芪对荷瘤小鼠一般状况的影响

M 组有化脓和死亡现象，小鼠双眼无神，反应迟钝，皮毛稀少干枯，食量减少，且肿瘤生长迅速；5-FU 组有化脓和死亡现象，小鼠双眼无神，反应和皮毛等未见明显改善，活动度降低，瘤体较M 组有减小趋势；5-FU+H 组和5-FU 后+H 组小鼠的生长状况良好，无死亡现象，毛发有光泽，反应较灵敏，体重稍有增加，瘤体生长明显减缓，但随着时间的延长，5-FU 后+H 组小鼠的各项指标明显优于5-FU+H 组。

2.2 黄芪对荷瘤小鼠体重的影响

M 组由于肿瘤生长迅速，荷瘤小鼠体重持续偏高；化疗期间（前7 d），各给药组荷瘤小鼠体重无明显差异，平稳缓慢增加；化疗结束后，各给药组小鼠前期体重变化较小，随着时间延长，荷瘤小鼠体重明显增加，且给药组中以5-FU 后+H 高剂量组、5-FU 后+H 中剂量组体重最高。从变化趋势可推测出，在一定时间内，随着时间的推移5-FU 组荷瘤小鼠的体重增加趋势逐渐减缓，其他给药组荷瘤小鼠体重稳步增加。见图1。

图1 黄芪对荷瘤小鼠体重的影响

2.3 黄芪对荷瘤小鼠肿瘤体积的影响

与M 组比较，各给药组小鼠肿瘤体积明显减小，差异有统计学意义（P＜0.05）；与5-FU 组比较，除5-FU 后+Hm 组（H 组）小鼠肿瘤体积明显减小（P＜0.05）外，其他各组均无显著差异。见图2。故后续实验主要针对H 组进行探究。

图2 黄芪对荷瘤小鼠肿瘤体积的影响

2.4 HE 染色

如图3 所示：M 组肿瘤细胞核小、量大、色深，并大量向周围组织（包括骨骼肌）侵袭，明显破坏周围组织，周围组织中新生血管丰富；与M 组比较，5-FU 组、H 组的肿瘤细胞对周围正常组织的侵袭程度依次逐渐减弱，新生血管依次逐渐减少，且H 组中形成了明显的包膜、新生血管少且管径小。

图3 肿瘤组织HE 染色

2.5 黄芪对荷瘤小鼠胸腺指数、脾指数的影响

与M 组比较，5-FU 组胸腺指数和脾指数明显下降（P＜0.05）；5-FU 组比较，H 组胸腺指数和脾指数明显升高（P＜0.05）。见图4。

图4 黄芪对荷瘤小鼠胸腺指数、脾指数的影响

2.6 黄芪对荷瘤小鼠淋巴细胞、中性粒细胞的影响

与M 组比较，5-FU 组淋巴细胞显著降低（P＜0.05）、中性粒细胞显著升高（P＜0.05）；与5-FU 组比较，H 组的淋巴细胞显著升高（P＜0.05）、中性粒细胞明显降低（P＜0.05）。见图5。

图5 黄芪对荷瘤小鼠淋巴细胞、中性粒细胞的影响

3 讨论

中医认为肝癌属于“肝积”“积聚”等病证范围，其主要病机为正虚邪实、本虚标实。正如《诸病源候论》中言：“积聚者，乃阴阳不和，脏腑虚弱，受于风邪，搏于脏之气所为也。”又如《杂病源流犀烛》言：“壮盛之人，必无积聚。必其人正气不足，邪气留着，而后患此。”说明正气不足是肿瘤（疾病）发生的内在因素，是根本之所在；而外邪是诱发肿瘤（疾病）的重要条件，是诱因；故扶正祛邪、攻补兼施为其主要治疗原则[12]。

叶淑芳等[13]收集了于2019 年1—12 月在广州市中西医结合医院就诊的肿瘤患者的用药处方，结果发现用药频次排名前15 的中药以补气药和补血药为主。黄芪作为最常见的抗肿瘤补气药之一，其抗肿瘤作用机制包括调节免疫、抑制肿瘤细胞转移、促进肿瘤细胞凋亡、抗氧化等[14]。肿瘤大小是量化药物是否具有抗肿瘤作用的基础指标[15]。本研究综合肿瘤大小及荷瘤小鼠生命质量探索黄芪联合化疗治疗肿瘤的最佳给药时间。研究发现，黄芪可改善荷瘤小鼠的生命质量，化疗后给予黄芪可进一步抑制肿瘤的生长；HE 染色结果表明，黄芪可抑制肿瘤细胞增殖、减少血管新生及对周围正常组织的侵袭。

5-FU 是目前常用的肿瘤化疗药物之一，效果显著，但其严重的毒副作用-胃肠道反应（恶心、呕吐）、免疫器官指数降低、免疫功能抑制、骨髓抑制等，亦不可忽视[3-4]。因此，提高免疫功能，增强机体自身抗肿瘤免疫反应在肿瘤治疗中显得至关重要。中性粒细胞是固有免疫系统中分布最广泛的白细胞之一，是机体的第一道天然防线，既是炎症形成的早期标志，还能参与机体免疫反应调节；淋巴细胞是体积最小的白细胞，具有免疫识别功能，通过启动细胞毒性免疫反应抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移，是肿瘤细胞免疫反应中的关键细胞。胸腺和脾脏是机体重要的淋巴器官，其功能与免疫反应密切相关。本实验通过剥离胸腺和脾脏，采集全血，获得了胸腺指数、脾指数、中性粒细胞计数和淋巴细胞计数。结果表明，注射5-FU 后小鼠出现免疫功能低下状态；化疗后给予黄芪，胸腺指数、脾指数、淋巴细胞明显升高，中性粒细胞明显降低，说明黄芪可改善5-FU 引起的免疫功能降低、炎性环境。

综上所述，黄芪可增强5-FU 的抗肿瘤作用，且化疗后给予黄芪效果更加明显，其抗肿瘤作用可能与黄芪能增强机体免疫功能、抑制肿瘤细胞增殖、减少血管新生、改善炎性环境有关。