蒙药文冠木配方颗粒指纹图谱及含量测定研究

刘梦，韩子璇，杨立茹，李佳，程岚*，张纯刚，2，3*（.辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 6620；2.长治医学院药学系，山西 长治 046000；3.祈蒙股份有限公司，内蒙古 赤峰 024330）

文冠木为无患子科植物文冠（Xanthoceras sorbifoliaBunge.）的干燥茎枝，蒙药名为“森登”，可分为乌兰-森登、沙日-森登、苏木-森登等[1]。文冠木性凉、涩，味甘、微苦，具有祛风除湿，消肿止痛，敛干黄水的功效，临床上常用于治疗风湿性关节炎、风湿内热及皮肤湿热等[2]。现代药理发现文冠木具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤和保护血管等作用[3]。文冠木在临床上的治疗范围涵盖了巴达干症、赫依症、关节炎、各类热症、丹毒等病症，疗效显著，同时也是“森登-4味汤”“文冠木十味汤”“云香十五味丸”的常用药，拥有悠久的用药历史[2]。但目前关于蒙药文冠木的药典介绍及文献研究都不够全面，因此，本研究建立指纹图谱和含量测定的HPLC方法，并对其中14种指标成分进行含量测定研究，以期为蒙药材文冠木二次开发利用及药典标准的提升提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

SHIMADZULC-2010AHT高效液相色谱仪（日本岛津公司，包括四元泵、UV紫外检测器、Lab Solution工作站）；CP225D十万分之一电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；SG3300H超声波清洗器（上海冠特超声仪器有限公司）；Y-2摇摆制粒机（上海天和制药机械有限公司）；WGL-230B电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.2 试药

对照品没食子酸（批号：110831-201906，纯度≥91.5%）、儿茶素（批号：110877-201604，纯度≥99.2%）、表儿茶素（批号：110878-201703，纯度≥99.2%）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG，批号：112072-202101，纯度≥98.0%）、鞣花酸（批号：111959-201903，纯度≥88.8%）、芦丁（批号：100080-202012，纯度≥91.6%）（中国食品药品检定研究院）；二氢杨梅素（批号：DSTSDE001201，纯度≥98.0%，乐天美医药）；没食子儿茶素（批号：CRN1039）、表没食子儿茶素（批号：CRN0842）、二氢槲皮素（批号：CRN0451）、杨梅素（批号：CRN2642）、槲皮苷（批号：CRN0353）、槲皮素（批号：CRN1117）、柚皮素（批号：CRN0343）（纯度≥98.0%，湖北萃园生物科技股份有限公司）。乙腈（瑞典欧森巴克化学公司，色谱纯），甲醇（天津市科密欧化学试剂有限公司，分析纯），磷酸（上海润捷化学试剂有限公司），纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司），文冠木药材细粉（批号WGM1～WGM15，祈蒙股份有限公司），经辽宁中医药大学康廷国教授鉴定为无患子科植物文冠（Xanthoceras sorbifoliaBunge.）的干燥茎枝。

2 方法与结果

2.1 蒙药文冠木配方颗粒的制备

称取200.00 g文冠木细粉（过100目），加入适量辅料混合均匀，采用湿法制粒，选择水作为润湿剂，将黏度适中、混合均匀的软材利用摇摆制粒机（14目筛）制成湿颗粒，后将其置于60℃的烘干箱中干燥，照粒度和粒度分布测定法（通则0928第二法双筛分法）测定，得到15批文冠木配方颗粒（S1～S15）置于阴凉处备用。

2.2 色谱条件

色谱柱：COSMOSIL 5C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（1～6 min，10%～13%A；6～11 min，13%A；11～25 min，13%～20%A；25～40 min，20%～40%A；40～50 min，40%A；50～60 min，40%～10%A）；流速1.0 mL·min－1；检测波长270 nm；进样量10 μL；柱温30℃。

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品溶液的制备 精密称定对照品适量，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇适量，超声（100 W，频率40 kHz，下同）15 min，放冷至室温，加甲醇定容，配制没食子酸、没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素、表儿茶素、EGCG、二氢杨梅素、鞣花酸、芦丁、二氢槲皮素、槲皮苷、杨梅素、槲皮素、柚皮素校正浓度分别为120.00、157.00、1315.00、320.00、252.00、150.00、186.00、105.00、100.00、100.00、100.00、67.00、150.00、250.00 μg·mL－1的单一对照品储备液。

2.3.2 供试品溶液的制备 取15批蒙药文冠木配方颗粒适量，研细，精密称取约0.500 g，置于10 mL量瓶中，精密称定，加90%甲醇适量，超声30 min，放冷至室温，用90%甲醇定容，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.3.3 混合对照品溶液的制备 精密称取各单一对照品储备液适量，加甲醇配制为校正质量浓度分别为4.80、18.37、153.40、28.67、64.75、6.06、30.00、5.25、3.92、11.57、5.40、7.14、15.00、4.30 μg·mL－1的混合对照品储备液，于4℃保存，待用。

2.4 指纹图谱的建立

2.4.1 参照物峰的选择 表儿茶素（8号峰）在15批样品中图谱中分离度好，稳定性较优，故选其作为色谱参照物峰，以计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。

2.4.2 稳定性试验 取同一批文冠木配方颗粒（S1）供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h进样检测，计算各个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果15批样品中的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均≤2.0%，表明供试品在室温下放置24 h稳定性良好[4]。

2.4.3 精密度试验 取同一批文冠木配方颗粒（S1）制备供试品溶液，连续进样6次，计算各个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果15批样品共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均≤1.4%，表明仪器精密度良好[5]。

2.4.4 重复性试验 按“2.3.2”项下方法制备6份文冠木配方颗粒（S1），进样检测，计算得到15批样品共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均≤1.7%，表明该方法重复性良好[6]。

2.4.5 指纹峰的指认 按“2.3.2”项下方法制备供试品，按“2.2”项下色谱条件检测，记录色谱图，与混合对照品色谱图比对保留时间，共指认14个共有峰，见图1。

图1 文冠木配方颗粒中色谱峰指认Fig 1 Chromatographic peak identification of Xanthoceras sorbifolia formula particles

2.4.6 指纹图谱的建立 制备15批文冠木配方颗粒供试品溶液，进样检测，记录色谱图。利用《中药指纹图谱相似度评价系统》（2012版）对色谱图进行分析，以S1为参照图，采用平均数法，经多点校正后，进行Mark峰匹配，系统生成15批配方颗粒的色谱图和对照图谱，标定21个共有峰，并与混合对照品的色谱图对比，指认14个色谱峰，分别为没食子酸、没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素、表儿茶素、EGCG、二氢杨梅素、鞣花酸、芦丁、二氢槲皮素、槲皮苷、杨梅素、槲皮素、柚皮素。15批文冠木配方颗粒指纹图谱见图2。

图2 15批文冠木配方颗粒指纹图谱Fig 2 Fingerprint of 15 batches of Xanthoceras sorbifolia formula particles

2.5 15批蒙药文冠木配方颗粒含量测定

2.5.1 专属性考察 取混合对照品储备液、90%甲醇（空白溶剂）及供试品溶液适量，进样检测，记录色谱图见图3，14个色谱峰峰形良好，无杂峰干扰，表明本方法专属性较强[7]。

图3 文冠木配方颗粒指纹图谱专属性考察Fig 3 Specific test for fingerprint of Xanthoceras sorbifolia formula particles

2.5.2 线性关系考察 精密量取“2.3.1”项下单一对照品储备液，加甲醇定容于10 mL量瓶中，再用甲醇逐级稀释成系列质量浓度的混合对照品溶液，得到校正浓度分别为各对照系列浓度。以峰面积为纵坐标（Y），对照品质量浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，计算回归方程，见表1。

表1 回归方程及线性范围Tab 1 Regression equation and linearity

2.5.3 加样回收试验 精密称取已知含量的6份文冠木配方颗粒，按对照品加入量与样品相应成分含量为1∶1的比例精密加入对照品溶液，按“2.3.2”项下方法处理后，进样检测，计算加样回收率，结果14种对照品平均加样回收率均在99.83%～106.96%，RSD值均≤1.8%[8]。

2.5.4 系统适用性考察 按照上述洗脱条件检测对照品和供试品溶液，记录色谱图，见图4。结果显示14个色谱峰峰形尖锐，对称性好；与前后峰的分离度均＞1.5，达到基线分离；理论塔板数不低于3000[9]。

图4 系统适用性试验色谱图Fig 4 Chromatogram of the system suitability test

2.6 15批文冠木配方颗粒含量测定

精密称定15批文冠木配方颗粒0.500 g，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，进样检测，记录峰面积，采用外标法计算15批文冠木配方颗粒中14种成分的含量，结果见表2。

表2 15批文冠木配方颗粒14种成分含量测定结果(%)Tab 2 Content of 14 components in 15 batches of Xanthoceras sorbifolia formula granules (%)

2.7 化学模式识别分析

2.7.1 相似度评价 将15批文冠木配方颗粒色谱图导入《中药色谱图相似度评价系统》（2012年版），选定信号吸收和峰形较优、稳定性良好的21个色谱峰，系统自动计算生成15批配方颗粒的相似度，结果相似度均大于0.900，说明蒙药文冠木配方颗粒的制剂工艺具有良好的稳定性，但峰面积大小存在差异，说明各批次间成分存在差异。

2.7.2 聚类分析 将15批文冠木配方颗粒峰面积导入SPSS 25.0软件，采用组间连接的聚类方法，以欧氏距离为测量区间，进行系统聚类分析，结果见图5。15批配方颗粒（S1～S15）分为3类，S1～S5、S10、S7、S12～S13、S15为Ⅰ类，S9、S11、S14为Ⅱ类，S6、S8为Ⅲ类，颗粒间质量差异较大，与相似度评价结果一致。原料药材的产地、采收期、加工方式等都会影响药材质量，说明仅以一个或多个指标成分不能完全评价文冠木配方颗粒的质量，需要通过指纹图谱最大程度地反映整体的特征信息。

图5 15批文冠木配方颗粒聚类分析图Fig 5 Cluster analysis of 15 batches of formula granules

3 讨论

3.1 试验条件的考察

考察了流动相系统（乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%醋酸水、乙腈-0.2%磷酸水、甲醇-0.1%磷酸水），柱温（20、30、40℃），检测波长（250、270、280、300 nm），流速（0.8、1.0、1.2 mL·min－1）对含量测定的影响，结果发现，乙腈-0.1%磷酸水溶液，流速1.0 mL·min－1，检测波长270 nm条件下各特征峰响应值高，基线平稳。比较不同提取溶剂（80%乙醇、60%甲醇、70%甲醇、80%甲醇、90%甲醇、100%甲醇），不同料液比（1∶10、1∶12、1∶20、1∶25）和不同提取时间（30、45、60 min）对文冠木配方颗粒的提取效果，结果确定料液比1∶20，以90%甲醇超声提取30 min时所测成分的含量及分离情况最佳，杂峰干扰少。

3.2 文冠木配方颗粒指纹图谱和含量测定结果分析

15批文冠木配方颗粒的指纹图谱与对照指纹图谱的相似度较高，均在0.900以上。由指纹图谱分析可知15批文冠木配方颗粒所含化学成分种类基本一致，但峰面积大小存在差异，聚类分析与相似度评价均提示各批次间成分含量存在一定差异性。目前市场流通的文冠木来源产地较为分散，地理环境影响了文冠木内代谢产物的生成和积累，并且各省市对药材验收的标准和限度各不相同，无法对文冠木进行客观准确的质控，是文冠木质量不稳定及开发利用受限的重要原因。

本研究在指纹图谱中共确认21个特征峰，指认出14个峰并进行含量测定，文冠木中含量最多的是黄酮类化合物，主要为黄酮化合物和二氢黄酮化合物，包括含量较高表没食子儿茶素、二氢杨梅素、二氢槲皮素、杨梅素等，是文冠木发挥抗炎、抗氧化、改善心血管系统的指标成分[10]；没食子酸作为有机酸类化合物也对细菌、真菌等具有抑制作用；表儿茶素、儿茶素、鞣花酸等多酚类化合物则使文冠木具有调节免疫、抗氧化及抗肿瘤等生物活性[11]，同时表儿茶素还具有抗凝血的作用等[12]。因此在指纹图谱基础上进一步对14种指标成分进行含量测定，为文冠木下一步的质量评价和药理活性研究奠定基础。由于含量测定与指纹图谱所用色谱条件相同，精密度、稳定性、重复性试验等方法学考察内容在指纹图谱中已考察且符合要求，因此，含量测定的方法学考察仅进行了线性关系、专属性和回收试验等内容。