基于LC-MS/ MS 的鹿角方中红景天苷在慢性心力衰竭大鼠心肌组织中的分布

时潇丽 马静雅 刘 力

上海中医药大学附属曙光医院药学部，上海 201203

红景天苷属于苯乙醇苷类化合物，是中药女贞子的有效成分之一，具有抑制细胞凋亡、抗感染、抗氧化等多种药理作用[1-2]；对缺血缺氧、力竭运动、化学品、生物毒素等引起的心脏损伤具有一定的心血管保护作用[3-5]。鹿角方来源于上海中医药大学附属曙光医院心内科胡婉英教授，其由鹿角胶、淫羊藿、女贞子、补骨脂、山茱萸、陈皮6 味药材组成，已在临床上安全使用20 余年，可补肾强心，改善慢性心力衰竭（以下简称“心衰”）的临床症状、保护心脏功能[6-9]。红景天苷原型药物是大鼠体循环系统中的主要暴露物质[10]；前期对鹿角方入血成分分析中发现，红景天苷是鹿角方在体内直接作用的主要物质之一[11]；但红景天苷在心肌组织的分布尤其是在病理模型中心肌组织的分布尚未探索。据此，本研究旨在通过LC-MS/MS 法，对鹿角方中红景天苷在慢性心衰大鼠心肌组织中的分布进行分析，以期为鹿角方的药理作用机制研究及临床用药提供参考。

1 实验对象

1.1 实验动物

SPF 级Wistar 雄性大鼠45 只，6～8 周龄，180～220g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK（沪）2013-0016，合格证号：2008001680211，动物使用许可证号：SYXK（沪）2014-0019。实验动物在上海中医药大学动物实验中心饲养，自由饮水、进食，温度18～24 ℃，动物实验方案经上海中医药大学动物实验伦理委员会批准（SZY201707010）。

1.2 仪器与试剂

1260 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；Triple-Quad 4500 质谱仪（美国AB SCIEX 公司）；SECURA125-1CN 十万分之一电子微量天平（德国Sartorius公司）；ME204E 万分之一电子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；NDK200-2 氮吹仪（杭州米欧仪器有限公司）；VtexMixer VX200 型涡旋振荡器（美国Labnet公司）；Legend micro 21R 高速离心机（美国Thermo Scientific 公司）；JXFSTPR-24 自动匀浆机（上海净信科技有限公司）；SK7200B 超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）。

鹿角方浸膏粉（每克浸膏粉相当于5.13 g 生药）由上海中医药大学附属曙光医院制剂实验室制备。红景天苷对照品（批号：110818-201507，含量99.4%）、地塞米松对照品（批号：100129-201506，含量99.8%）购于中国食品药品检定研究院；甲醇（HPLC/MS 级）、乙腈（HPLC/MS 级）购于德国CNW。

2 方法与结果

2.1 对照品、内标及质控样品溶液的配制

对照品溶液配制：取红景天苷、地塞米松对照品适量，精密称定，置于10 ml 棕色容量瓶，加入甲醇溶解并定容，配制对照品储备液。取红景天苷对照品储备液适量，用50%甲醇水溶液逐级稀释成38.240、76.480、152.960、764.800、1 529.600、7 648.000、15 296.000、38 240.000 ng/ml 标准溶液。

内标溶液配制：取地塞米松对照品储备液适量，用50%甲醇水溶液稀释成50.000 ng/ml。

质控样品配制：取红景天苷对照品储备液适量，配制成低（2.390 ng/ml）、中（47.800 ng/ml）、高（956.000 ng/ml）3 种浓度的心肌组织匀浆液质控样品。

2.2 色谱及质谱条件

色谱条件：Phenomenex Luna-C18色谱柱（2.0 mm×100 mm，5 μm），流动相A 为水，流动相C 为乙腈，洗针液为50%甲醇水溶液，采用梯度洗脱[12]。洗脱条件：0.0～0.2 min，5%C；0.2～1.5 min，5%→20%C；1.5～5.0 min，20%→70%C；5.0～6.0 min，70%→90%C；6.0～8.0 min，90%C；8.0～8.1 min，90%→5%C；8.1～11.1 min，5%C。流速0.8 ml/min，柱温40 ℃，样品室温度4 ℃，进样量10 μl。

质谱条件：采用电喷雾离子源，多反应监测模式检测，负离子模式检测；气帘气为25.0 psi，碰撞气为9.0 psi，粒子喷雾电压为-4.5 kV，离子源温度为550 ℃，雾化气为55 psi，辅助气为55 psi[12]。红景天苷m/z 299.1→118.1，地塞米松m/z 437.2→361.2。

2.3 慢性心衰大鼠模型建立与动物分组

45 只大鼠按简单随机抽样法选取8 只作为假手术组，其余大鼠行腹主动脉缩窄手术进行慢性心衰大鼠模型的构建[13-14]。大鼠术前禁食，腹腔麻醉，仰卧位固定，于剑突下0.5 cm 沿腹中线打开腹腔，切口约1.5 cm，拨开肠道，钝性分离左、右肾动脉之间腹主动脉，在离左肾动脉开口上缘0.5 cm 处将自制L 型钝头不锈钢针（外径0.6 mm）与腹主动脉结扎，立即抽离不锈钢针，结扎处见明显窄缩，缝合切口。术后保温，肌肉注射青霉素，连续3 d。假手术组开腹暴露腹主动脉，不结扎，其余同模型组。

术后4 周将存活的32 只模型大鼠按体重进行区组随机分组：模型组、鹿角方低剂量组（1.100 g/kg）、鹿角方中剂量组（2.200 g/kg，临床等效剂量）、鹿角方高剂量组（4.400 g/kg），每组8 只。

2.4 给药方案与心肌组织样品的采集

假手术组、模型组大鼠给予纯水，鹿角方低、中、高剂量分别由鹿角方浸膏粉加纯水配制成0.160、0.315、0.640 g/ml 的混悬液，各组大鼠给药容量均为7 ml/kg，1 次/d，连续30 周。末次灌胃给药2 h 后麻醉大鼠，腹主动脉取血，采集心脏，生理盐水清洗残留血液后，立即分离左心室及右心室壁，液氮立即冻存，-80 ℃保存备用。

2.5 心肌组织样品预处理方法

将大鼠心肌组织从-80 ℃冰箱中取出，冰浴下解冻，取适量组织剪碎，精密称定，加入4 倍量预先冰浴的超纯水，于冰浴下匀浆。前处理过程参考文献[12]，具体如下：精密吸取300 μl 匀浆液，加入10 μl 内标溶液，涡旋震荡1 min，加入4 倍量预先冰浴的乙腈沉淀蛋白，涡旋震荡1 min，10 000 r/min，4 ℃离心10 min（离心半径：86 mm）。取上清液于常温下氮吹干，精密加入150 μl 50%甲醇水溶液复溶，涡旋震荡2 min，10 000 r/min 低温离心10 min，取上清液进行LC-MS/MS分析。

2.6 方法学考察

2.6.1 专属性、定量下限（lower limit of quantification，LLOQ）考察 精密吸取空白大鼠心肌组织匀浆液300 μl，除不加入红景天苷对照品和内标溶液外，其他按照“2.5”项下方法操作、“2.2”项下条件分析，得到大鼠空白心匀浆液的色谱图；配制LLOQ 心肌组织匀浆样品，依同法处理，得相应标准样品色谱图。红景天苷的保留时间为2.66 min，在该方法处理下大鼠心肌组织匀浆液中内源物质在相应出峰时间不干扰样品的测定，化合物峰形良好（图1）；LLOQ 为1.195 ng/ml，满足信噪比（S/N≥10）。

图1 心肌组织匀浆液色谱图

2.6.2 线性关系考察 精密吸取大鼠空白心肌组织匀浆液300 μl，分别精密加入“2.1”项下不同浓度的红景天苷对照品溶液10 μl，加入10 μl 内标溶液，涡旋混匀1 min，配制成含红景天苷浓度为1.195、2.390、4.780、23.900、47.800、239.000、478.000、1 195.000 ng/ml的心肌组织匀浆液，按“2.5”项下方法操作、“2.2”项下条件分析，以红景天苷浓度为横坐标，待测物与内标物峰面积比值为纵坐标，作加权线性回归计算。红景天苷在1.195～1 195.000 ng/ml 范围内线性关系良好（r＞0.999）。

2.6.3 精密度与准确度试验LLOQ 及低、中、高浓度的心肌组织匀浆液质控样品，加入10 μl 内标溶液，每个浓度平行6 份，连续配制与平行测定3 d，根据标准曲线计算样品浓度。准确度为测定浓度与标称浓度的相对偏差（relative error，RE）的平均值，精密度为测定浓度的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。低、中、高浓度质控样品中红景天苷精密度RSD%均＜15%，准确度为90.817%～106.500%（表1）。

表1 方法精密度与准确度结果（n=6）

2.6.4 回收率与基质效应实验 低、中、高浓度心肌组织匀浆液质控样品，加入10 μl 内标溶液，按“2.5”项下操作、“2.2”项下条件分析，计算红景天苷与内标峰面积比值（A）；相应低、中、高浓度对照品溶液10 μl和内标溶液10 μl，加入经按“2.5”项下操作至氮吹后的空白血浆基质中，再加入50%甲醇水溶液（130 μl）复溶，分析得红景天苷与内标峰面积比值（B）；平行配置成如上相应浓度的对照样品标准溶液进行分析，分析得红景天苷与内标峰面积比值（C）。以上3 种配制方法每个浓度平行操作6 份。参考《药物分析（第八版）》[15]体内样品分析方法验证，相对回收率=A/B×100%，基质效应=B/C×100%。质控样品中红景天苷的相对回收率为95.222%～100.814%，基质效应RSD%均＜15%（表2）。

表2 红景天苷在心肌组织样品中的相对回收率及基质效应（n=6）

2.6.5 稳定性实验 低、中、高浓度心肌组织匀浆液质控样品，加入内标溶液10 μl。分别考察样品冰浴放置1 h、前处理后在室温放置6 h、自动进样器（4℃）放置24 h 和48 h 的稳定性，每个浓度平行操作6 份。结果显示，红景天苷在上述条件下的稳定性良好（表3）。

表3 稳定性结果（，n=6）

表3 稳定性结果（，n=6）

2.7 红景天苷在大鼠心肌组织中的分布

红景天苷在左、右心室壁的含量随给药剂量的增加而升高，采用线性拟合方法分析红景天苷含量与给药剂量的关系，其中红景天苷在右心室壁含量与给药剂量线性拟合值R2为0.983（图2）。中、高剂量鹿角方组中红景天苷在左心室壁的含量为右心室壁含量的（47.383±12.156）%、（43.805±9.644）%，红景天苷在慢性心衰大鼠心脏左、右心室的分布不同（表4）。

表4 鹿角方中红景天苷在大鼠左、右心室壁中的含量（）

表4 鹿角方中红景天苷在大鼠左、右心室壁中的含量（）

注-：未对样品分析。LLOQ：定量下限。

图2 红景天在慢性心衰大鼠右心室的含量与给药剂量的线性关系

3 讨论

病理状态下，病变的组织器官可能影响药物的分布行为[16]。本研究发现，红景天苷在模型大鼠心脏左、右心室壁的分布存在差异。腹主动脉缩窄法是慢性心衰动物模型的常用方法之一，其可引起大鼠压力负荷型左心室心肌肥厚[17]；而长期后负荷过重最终造成心脏功能失代偿形成心衰[18]。过度肥大的心肌具有不平衡生长的特性，即心肌细胞体积的增长超过血管的生长，导致毛细血管分布的密度相对下降，造成不同程度的缺血、缺氧。因此，模型大鼠左心室肥厚区单位面积血流量是下降的，前期研究结果可知该模型造成的左心室心肌肥厚病理改变明显大于右心室，推测上述是造成红景天苷在左、右心室分布不同的原因[12]。

生物样品前处理是药动学研究过程中的关键步骤[19]。某些分析物在前处理中易受生物样品中的酶、环境温度、pH 值等因素影响而发生降解，导致药物在组织中的含量被低估[20]。分析物的稳定性是体内药物分析结果准确和可重复的重要因素，通常应考察质控样品从冰箱储存条件到室温或样品处理温度的稳定性及前处理环境（通常为室温）短期放置的稳定性[21-24]。在前期质控样品3 次反复冻融（-80℃→室温）稳定性及室温2、6 h 稳定性的预实验考察中发现，红景天苷含量降低，且样品中的红景天苷在室温放置时间越长含量下降越多，经质谱分析为红景天苷向其降解产物酪醇转化，基于纯水及空白基质对红景天苷含量无明显影响，结合文献推测组织匀浆液中所含酶可能是红景天降解的原因之一[12，25]。在本研究中考察了样品冰浴放置1 h 稳定性，结果显示稳定性符合要求。提示将样品置于冰浴环境并缩短前处理放置时间，可改善样品室温放置中红景天苷的降解现象，该现象可能与低温下酶的活性被抑制，红景天苷被酶解的速度降低有关。总之，为了保证检测数据的准确性，心肌组织取样后应立即分离后液氮快速冻存，以抑制酶的活性，分析时样品组织匀浆后应在冰浴下尽快处理（1 h内），不应进行反复冻融。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。