基于角蛋白酶和纳米电气石粉改进的复合酶制剂脱毛工艺研究

温会涛，林可心，王小卓，牛泽，刘琳，但卫华

（1.福建省皮革绿色设计与制造重点试验室，福建晋江 362271；2.中国轻工业制革绿色工程实验室，福建晋江 362271；3.兴业皮革科技股份有限公司国家企业技术中心，福建晋江 362261；4.四川大学制革清洁技术国家工程研究中心，四川成都 610065）

1 引 言

制革包括一系列的化学（包括生物化学）和机械处理过程，如除去毛和非胶原纤维等，使真皮层胶原纤维适度松散、固定和强化，再加以整饰（理），从而使生皮变成皮革。脱毛是制革工艺中重要的一环，其主要目的为除去毛发与表皮，松散胶原纤维，并进一步去除脂肪和胶原纤维间质。脱毛的方法可分为毁毛法和保毛脱毛法，考虑到对环境的影响，目前制革工业采用的是保毛脱毛法。保毛脱毛法工业应用最广的为低灰保毛脱毛法，其核心在于先用少量的石灰进行护毛处理，然后再用还原剂破坏毛与皮的连接，从而达到脱毛的目的[1]。最常用的还原剂为硫化物，脱毛后会排放含硫废液，存在一定的硫污染。为减少脱毛处理带来的硫化物污染，改进的脱毛方法有酶脱毛[2-4]、氧化脱毛[5]以及有机物脱毛[6]等。

通过设计合理的复合酶制剂[7]，并应用于制革脱毛工序[8,9]，已取得了较好的应用效果。为进一步提升该酶制剂的应用效果，引入了角蛋白酶和纳米电气石粉。脱毛试验结果表明，其具有优异的脱毛效果，即使最难脱毛的黑色成年牛皮，脱毛率也达到95%以上。

2 试 验

2.1 材料与设备

浸水裸皮，自制，采用同一批次、张幅接近的黑色成年牛皮；复合酶制剂A，自制；角蛋白酶K，工业级，夏盛生物科技开发有限公司；纳米电气石粉F，工业级，灵寿县白飞矿产品加工厂；石灰精粉，工业级，四川吉龙化工有限公司；氢氧化钠、氯氨-T、柠檬酸、高氯酸，AR，成都金山化学试剂有限公司；对二甲氨基苯甲醛、羟脯氨酸（Hyp），AR，上海麦克林试剂有限公司。

试验转鼓，800× 400，无锡市新达轻工机械有限公司；生物显微镜，CX-41，日本Olympus 公司；UV-vis 光谱仪，U3900H，日本HITACHI 公司；精密pH 计，pHS-3，上海雷磁仪器厂；精密分析天平，FA2004N，上海菁海仪器有限公司。

2.2 脱毛工艺

酶脱毛在转鼓中进行。首先，将经过浸水工艺处理的裸皮投入转鼓中，控制液比0.8～1.0，转速6～8 rpm，内温26～28℃，调节pH 为9.0～9.5，转10～30 min；再加入固定化复合酶制剂0.3%～0.5%，转10～60 min；然后加入角蛋白酶0.1%～0.5%和电气石粉0.3%～1.5%，转10～60 min；检查脱毛情况，若脱毛率＞90%，进行下一步；否则，继续转60～120 min。控制液比0.2～0.3，转速3～5 rpm，内温23～26℃，加入熟石灰2.0%；然后在转动中加入氢氧化钠溶液0.15%～0.2%，转动60 min 后检查裸皮上小毛的脱除情况，视情况延长转动时间直至小毛完全脱净；然后，补水使液比达到2.0～2.5，并在转动中加入已溶解的氢氧化钠0.15%～0.2%，先转动60 min，再转5 min 停55 min，转4～6 次，停鼓过夜。次日，转30 min，出鼓，得到脱毛的浸灰裸皮。

2.3 检测指标与方法

2.3.1 脱毛率

脱毛率表示牛皮上已经脱除毛的面积所占的比例。脱毛率根据脱毛情况进行估算，或将已部分脱毛的牛裸皮拍照（图1a），再经图像处理[10]后（图1b）分别计算已脱毛的面积（S1，图1c）和未脱毛的面积（S2，图1d），并根据式（1）计算脱毛率。

图1 脱毛率计算示意图

式中：T 为脱毛率，%；S1为已脱毛的面积，S2为未脱毛的面积。

2.3.2 脱毛液中羟脯氨酸含量的测定

采用氯氨-T 氧化、对二甲氨基苯甲醛显色法测定[11]。首先，取一定量的消解液，加入柠檬酸缓冲液和氯氨-T，混匀后放置5 min；再加入高氯酸、对二甲氨基苯甲醛，混匀后在65℃下保温15 min，然后在冷水浴中冷却，静置30 min 后测定560 nm 波长处的吸光度值。以未加入羟脯氨酸的试样为空白，根据标准曲线算出废液中羟脯氨酸含量[12]。

2.3.3 脱毛粒面完整性的评价

对脱毛后粒面的完整性进行感官评价[1]，重点观察脱毛裸皮的粒面、肉面情况，基本要求粒面无小毛、无毛根残留、无损伤、无污染；肉面无附着牛毛，无污染；最高分为10 分，最低分为0 分，可计0.5分。

3 结果与讨论

3.1 基于TRIZ 理论的皮革脱毛问题分析

从皮的组织结构与化学组成上看，皮由表皮和真皮组成，两者通过基底膜相连；毛由毛干、毛根和毛球组成，毛根和毛球位于毛囊中，毛囊是表皮凹入真皮内所形成的囊状空腔；在毛囊的最下端，毛袋凸入毛球内，形成毛乳头，毛球包裹着毛乳头。因此，毛与皮的连接作用包括毛囊与毛球之间的包裹作用，毛球与毛乳头之间的包裹作用，以及毛根与毛囊之间由粘蛋白、类粘蛋白等形成的粘接作用。而脱毛就是要破坏这些作用，使毛与皮分离。

为提升皮革脱毛工艺的清洁生产水平，酶脱毛深受青睐。在前期研究中，开发了复合酶制剂及其固定化技术，并进行初步试验[13]。初步研究结果显示，以碱性蛋白酶、中性蛋白酶、弹性纤维酶、脂肪酶和糖苷酶复配的复合酶，采用羧甲基纤维素- 聚乙烯醇微球固定后，酶活力约为2 万单位/克[7]，其最佳脱毛条件为：酶用量200 u/g（也就是1%）、温度25℃、pH=8.5、时间3 h，脱毛率＞90%，对皮基本无损伤，且废液中S2-、COD 含量较传统灰碱法有大幅降低。为进一步优化复合酶制剂配方，提高酶脱毛效率与适用性，试图应用TRIZ 理论进行分析与改善。

3.1.1 系统分析

对酶脱毛技术系统进行多屏幕分析如图2 所示。

图2 酶脱毛技术系统的多屏幕分析

从酶脱毛的当前系统（CS）出发，浸水皮的状况由其前工序（浸水）所决定，同时与原料皮的状况如兽源、皮龄、张幅、毛发颜色等密切相关；而酶制剂则由其组成与配比所决定。因此，可适当调整浸水工艺，使其易于脱毛；同时酶制剂的设计与制备也至关重要。在系统的未来，下一工序为浸灰，主要目的为进一步松散胶原纤维，那是否可以同时除去残留的毛根或小毛？同时，脱掉的毛应尽快分离除去，废液中的酶应考虑回用，以减少废液排放。

在其子系统中，需要关注的是微观下毛与皮的连接，以及相应酶对其产生的具体作用。这涉及到皮的组织学与酶的生物学的相关研究。在其超系统中，需要关注酶脱毛浓度、温度、酸碱度、作用时间以及机械作用等的影响因素，并考虑如何精准控制。酶脱毛技术不能大规模应用的原因之一就是难以控制，易造成质量问题。同样，在脱毛系统的过去和未来的子系统和超系统中，也可以寻找酶脱毛的影响因素和控制手段。

3.1.2 功能分析

毛与皮间的连接作用受到毛根鞘、毛乳头、弹性纤维、纤维间质、脂腺等影响，其中毛乳头和毛根鞘成分复杂，由角蛋白、胶原蛋白、蛋白多糖等多种成分组成[14]。酶脱毛是利用酶的专一作用选择性地破坏毛与皮之间的连接，从而使两者分离[15]。复合酶则利用多种酶的作用，蛋白酶有利于除去胶原纤维间质，但过度则对皮胶原纤维造成损伤[16]；淀粉酶、糖化酶则可以除去胶原纤维间的蛋白多糖、糖蛋白，松散胶原纤维[17]；胰酶则有一定的脱脂效果；弹性蛋白酶则可以适度水解弹性纤维；利用其协同效应，提高酶脱毛效果[18]。

酶脱毛技术系统的功能分析如图3 所示。从功能分析上讲，酶脱毛的功能为破坏（毛与皮之间的）连接。当这些连接被破坏后，通过转鼓的旋转和皮张之间的摩擦可容易地使毛脱除。结合皮组织结构，对脱毛而言，表皮与粘接物质与真皮间的连接功能是过度的，以及粘接物质对毛囊、毛球、毛乳头之间的粘接作用是有害的，这是导致复合酶对被脱除物之间作用力不足的关键。同时，复合酶对皮胶原纤维之间过度的水解作用是有害的，其会造成脱毛出现质量问题，是阻碍酶脱毛技术应用的瓶颈。另复合酶还会对毛存在一定的水解作用，但毛作为工业废弃物，故暂不考虑。综上，酶脱毛的功能为破坏毛与皮之间的连接，目的是除去毛、表皮等脱除物。

图3 酶脱毛技术系统的功能分析

3.1.3 资源分析

应用物场分析法进行资源分析。TRIZ 理论认为，任何复杂的工程系统都是由一系列最简单的工程系统组成；最简单的工程系统由两个物质和一个场组成，其中场可以理解为两个物质间的相互作用[19]。以复合酶（S2）与待脱除物（S1）进行物场分析，S2对S1的作用场F1为复合酶的水解作用场，建立物场模型如图4 所示。

图4 酶脱毛技术系统的物场分析

根据TRIZ 理论资源分析法，采用物场分析进行资源分析[20]，从物S1和S2及其组合、以及场F1，从物质、能量、信息、时间、空间和功能等方面寻找资源，结果见表1。

表1 酶脱毛技术系统的资源分析

对S1和S2而言，其组成至关重要，由于酶具有专一性，故S1与S2具有相关性，不同组合可能带来不同的脱除效果。脱掉的S1，使用后的S2，前后工艺，都是值得考虑的资源。脱毛之后工序是浸灰，浸灰工序的功能为松散胶原纤维，具有去除表皮和纤维间质的能力，故浸灰可对残留的毛（如新毛和小毛）具有一定的处理能力。因此，脱毛率达到90%以上即可进入浸灰工序。

3.1.4 基于T R I Z 理论的皮革脱毛生态工艺设计

根据物场分析（图4a），复合酶对被脱除物的物场模型属于有用但作用不足的问题物场模型（图4b），解决该类物场问题一般采用第2 类标准解（增强物场模型）和第3 类标准解（向超系统和微观级系统进化的物场模型），前者增加物质或场及其强度，后者则向超系统和子系统进化[19]。尝试运用多个S2，即引入S3、S4（图4c），以提高脱除效率。由于S1中存在角蛋白[9]，而角蛋白酶可特异性降解角蛋白，且已在脱毛试验中取得了较好的效果[21-23]，因此，S3为角蛋白酶。相关研究表明，电气石能调节水的pH[24]并具有活化作用[25]，能提高酶的活性[26,27]，故引入的S4为电气石粉。改进方案提出，在新一代的脱毛复合酶中引入了S3和S4，考察其对S1的脱除效果。为了描述方便，将原有的复合酶制剂命名为A，而经过角蛋白和纳米电气石粉改进后的酶制剂命名为B。

3.2 复合酶制剂的改进与优化

3.2.1 基于单因素的复合酶制剂改进研究

以脱毛率、粒面的完整性和脱毛液中羟脯氨酸的含量为评价指标，采用单因素考察角蛋白酶K、电气石粉体F 对复合酶A 脱毛性能的影响。

3.2.1.1 角蛋白酶K 用量对复合酶A 脱毛性能的影响

在复合酶A 用量为待脱毛的浸水皮重量0.5%时，加入浸水皮重量0.1%～0.5%的角蛋白酶K，保持其他工艺条件不变，考察改进后酶制剂的脱毛效果。从图5 可以看出，加入0.2%的角蛋白酶K 后，绒毛脱除效果较好。这可能是因为绒毛易受角蛋白酶作用，从而使其易于被去除。

图5 脱毛效果对比

从图6 可以看出，加入一定量的角蛋白酶K后，脱毛率有所提高，这表明角蛋白酶能有效降解毛发中存在的双硫键，从而使其水解达到脱毛的目的；粒面完整性良好，加入角蛋白酶K 基本不影响裸皮粒面，当加入量大于0.3%时略有下降；废液中羟脯氨酸浓度不会因加入角蛋白酶K 而显著升高。这表明角蛋白酶K 具有较好的专一性，能作用于角蛋白或毛囊中的角质组织，而对胶原蛋白影响较小。

图6 角蛋白酶K 的用量对复合酶A 脱毛效果的影响

3.2.1.2 电气石F 用量对复合酶A 脱毛性能的影响

在复合酶A 用量为待脱毛的浸水皮重量0.5%时，加入浸水皮重量0～1.5%的电气石粉F，同时保持其他工艺条件不变，考察改进后的酶制剂的脱毛效果。

从图7 可以看出，加入电气石F 后，脱毛率略有上升，当加入量为0.9%时，脱毛率达到90%；而对粒面的完整性和脱毛液中的羟脯氨酸浓度则基本上没有影响。这可能是因为纳米电气石粉对酶有一定的固定作用[28]，提高了酶的稳定性[29]，同时电气石可以释放出负氧离子，可能对复合酶A 中的酶具有一定的促进作用[30]，从而使脱毛效率提高。

图7 电气石粉F 的用量对复合酶A 脱毛效果的影响

进一步试验证明，同时加入角蛋白酶K 和电气石F，有助于提高脱毛率，而对粒面的完整性和脱毛液中的羟脯氨酸浓度影响很小，说明其对胶原纤维作用较小，不会破坏粒面。在硫氢化钠、硫化钠存在的条件下，添加角蛋白酶K 与电气石粉F 的复合酶A 的脱毛效果没有明显改变，这说明复合酶也适用于现有的基于硫化碱的脱毛工艺。

3.2.1.3 添加顺序对复合酶A 脱毛性能的影响

将0.2%的角蛋白酶K 和0.9%的电气石F 混合后作为改进剂，考察加入顺序对复合酶A 脱毛性能的影响。将加入顺序设置为先加、同时加和后加，间隔时间为1 h，以脱毛率为评价指标，发现后加的效果最好（约95%），同时加的效果次之（约90%），而先加的效果最差（约85%，与未添加的效果接近）。这可能与Friedrich J.的推测比较接近，即角蛋白酶易与暴露的角质层反应，而渗透则相对困难[31]，协同脱毛机理有待进一步研究。鉴于脱毛率达到90%亦能满足工艺要求，为了酶制剂制备及脱毛工艺操作的便利性，采用酶制剂同时制备，脱毛时同时添加的策略。

3.2.2 基于正交设计的酶制剂优化研究

3.2.2.1 复合酶B 组分优化试验设计

采用酶脱毛工艺，以脱毛率、粒面的完整性和脱毛液中羟脯氨酸的含量为评价指标，以复合酶A、角蛋白酶K、纳米电气石粉体F 的用量为因素，根据单因素试验结果将每个因素设置3 个水平，采用正交设计法（L9(43)）考察复合酶B 的组成对脱毛效果的影响（见表2）。

表2 复合酶B 组分优化正交设计

3.2.2.2 评价指标的归一化与加权处理

在脱毛性能的评价指标中，脱毛率能直观表示脱毛效果，粒面的完整性和脱毛液中羟脯氨酸的含量则用来评价脱毛工序对皮身的影响。为比较准确评价某一方案，需对检测结果进行归一化处理。此处采用百分制，即将检测结果转化为百分制。对脱毛率而言，工艺要求是达到90%以上，因此将脱毛率为90%时设置为80 分，脱毛率为100%时设置为100分，按表3 中公式（1）计算脱毛率的归一化值；对粒面完整性而言，由于评价值为10 分制，直接转化为百分制即可；对废液中的羟脯氨酸浓度而言，检测值较低（2.5～5.1 mg/L），为了区别，将浓度为2.5 mg/L设置为95 分，5.0 mg/L 设置为85 分，得出表3 中公式（3）。这样，可将检测值转化为一个无量纲的值，方便进行运算处理。

表3 酶脱毛检测指标的归一化

由于评价指标较多，各个指标的重要性并不一致，因此需要进行加权处理，加权处理采用指标比较法[32]。以C1（脱毛率）对比C2（粒面完整性）为例，若C2的重要性为1，对比出C1的重要性为2，则c12（第1 行第3 列）为2（2∶1）。同样算出所有的对比值，按列分别求和，和的倒数即为权重，见表4。将归一化后的值分别与权重相乘，得到该指标的权重值。

表4 酶脱毛检测指标的权重

3.2.2.3 复合酶组分优化试验讨论

将各脱毛试验的检测结果进行归一化、加权化处理，结果见表5。对试验结果进行直观分析，见表6和图8。

表5 复合酶B 脱毛评价结果

表6 复合酶B 脱毛正交试验结果

图8 复合酶B 脱毛正交试验结果直观分析

从试验结果（表6）上看，所有的方案均具有较好的脱毛效果，其中方案7 的综合评价最好，在牛毛被脱除的同时保留有较好的粒面，同时废液中羟脯氨酸浓度较低。

进一步分析表明，复合酶A、角蛋白酶K 和电气石粉F 对脱毛效果影响的大小为：复合酶A＞角蛋白酶K＞电气石粉F，这也间接说明角蛋白酶K和电气石粉F 对复合酶A 具有辅助作用。就复合酶A 而言，用量越大，脱毛效果越好，这在实际应用中会为追求脱毛率而加大复合酶用量，从而使其难以控制，存在安全隐患。角蛋白酶K 具有类似复合酶A 的脱毛效果，但其对胶原作用相对较弱，因而具有较好的安全性能。而对电气石粉F 而言，需要加入一定的量（＞0.5%）才能对脱毛效果起促进作用，可能是其对酶具有固载和活化作用。由于复合酶A、角蛋白酶K 和电气石粉F 用量越高，脱毛效果越好（见图8），因此直观分析最佳方案为复合酶A 0.6%、角蛋白酶K 0.4%和电气石粉F 1.0%。与方案7 相比，其区别在于角蛋白酶K 的用量。由于低用量时它也具有较好的脱毛效果，同时粒面完整性更好，脱毛液中羟脯氨酸含量更低，因此确定最佳方案为方案7，即复合酶A 0.6%、角蛋白酶K 0.2%和电气石粉F 1.0%。

以方案7 制备改进的脱毛复合酶（改进复合酶B），将其应用于胎牛皮、中小牛皮、轻磅黑白花阉牛皮以及成年黑色牛皮的脱毛工艺，均取得了较好的脱毛效果，即使最难脱毛的黑色成年牛皮，脱毛率也达到95%以上，符合工艺要求。

3.3 复合酶脱毛工艺技术评价

以待脱毛黑色成年牛皮为研究对象，以脱毛效果、安全性能、污染负荷、革身性能、可操作性以及工艺成本为评价指标，对灰碱法保毛脱毛、复合酶A和改进复合酶B 脱毛工艺进行对比研究，结果见表7。总而言之，复合酶A 较灰碱法污染负荷低，改进复合酶B 具有更好的脱毛效果、更高的脱毛安全性能和更低的污染负荷，但在革身性能、可操作性与工艺成本方面酶脱毛与灰碱法相比稍逊一筹，有待进一步的改进。

表7 脱毛工艺技术评价

4 结 论

采用TRIZ 理论将脱毛工序存在的待改进问题定位于皮革脱毛体系，结合前期的复合酶脱毛技术研究基础，分别对其进行系统分析、功能分析、资源分析和物场分析，提出引入角蛋白酶和电气石粉的创造性改善方案；应用单因素与正交设计对改进的复合酶制剂B 配方进行优化，得到最佳配比为：复s合酶A 0.6%、角蛋白酶0.2%和电气石粉1.0%；该复合酶制剂适用于现有酶脱毛浸灰工艺，脱毛率＞95%，粒面完整性好。这为制革酶脱毛提供了新的技术支撑。