葡萄CYP707A 基因家族的鉴定及对果实成熟的功能验证

龚丽丽 余花 杨杰 陈天池 赵双滢 吴月燕

（1.上海海洋大学水产与生命学院，上海 200120；2.浙江万里学院，宁波 315100）

葡萄（Vitis vinifera L.）是一种具有较高营养价值和经济价值的非呼吸跃变型水果。水果的成熟期是其营养品质和适口性的关键影响因素［1］。中国南方葡萄成熟期往往伴随着高温、台风和强降水等不利环境的影响。如何有效的避开不利生长季节对于葡萄生长和产业发展具有重要意义。

脱落酸（ABA）是一类在非呼吸跃变型果实起着重要作用的植物激素［2］。研究表明ABA 的积累可以通过激活上游NCED 酶或抑制下游ABA 8'-羟基化酶活性来调控植物生长［3］。有3 种不同的ABA 羟化途径可以导致ABA 失活，通过氧化环结构不同的甲基（C-7'、C-8'和C-9'）影响内源ABA 的积累［4］。但ABA 8'-羟化酶编码基因CYP707A，通常被认为是主要的ABA 分解代谢途径。ABA 经CYP707A可被分解为相酸（PA），最终代谢产物为二氢相酸（DPA）［5］。研究表明，ABA 分解代谢的产物PA 在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中的特定组织中可以激活ABA 受体PYL，在ABH2-1 突变体与过表达AtCYP707A3 杂交植株中，由于PA 降解途径被阻断和过量分解ABA，造成高PA 和低ABA 内源环境，这种植株并没有表现出一些ABA 生物合成突变体所观察到的生长迟缓，意味着8'-羟基化的途径不仅是ABA 一个失活反应，同时在某些方面如低ABA 条件下具有补偿作用［6-7］。另一项研究表明，ABA 9'-羟基化也被CYP707As 催化，这是ABA 8'-羟基化的一个副反应［8］。研究表明CYP707As 是独脚金内酯信号通路的效应物［9］。CYP707As不仅调控ABA稳态，还参与信号通路过程。

近年来，ABA 8'-羟基化反应的关键酶已从许多植物中分离出来，并被证明在植物发育中发挥重要作用。从拟南芥中分离到4 个CYP707A 基因，其中AtCYP707A2 在种子萌发中起着至关重要的作用［10］。苹果（Malus domestica Borkh）中鉴定出的MdCYP707A2.3 对苹果树延迟开花和解除休眠起到关键作用［11］。然而，关于CYP707A 在非呼吸跃变型水果中的作用却知之甚少。在草莓（Fragaria ananassa Dchesne）中鉴定出4 个FaCYP707A 基因，这些基因可能在草莓果实发育过程中发挥组织特异性作用，FaCYP707A3 可以让植株适应盐胁迫［12］。樱桃（Prunus avium L.）CYP707A1 和PacCYP707A3在水分胁迫和ABA 处理下受到正调控［13］。这些结果表明，CYP707A 基因家族在植物代谢中发挥着不同的作用，可以在各种胁迫下通过转录调控内源性ABA 水平，使植物更好地适应环境。

阐明果实成熟的调控机理对提升果实品质和提高经济效益具有重要的指导意义，近年来，ABA合成和信号传递在葡萄果实成熟中的调控机制已被广泛关注［14］，但ABA 分解代谢酶在葡萄果实成熟中鲜有报道。本研究采用生物信息学方法鉴定VvCYP707A 基因家族成员，并分析其家族成员的理化性质、系统进化、基因结构、蛋白保守结构域和顺式作用元件；通过qPCR 对VvCYP707As 的时空表达和组织表达特异性进行分析，并结合瞬时表达验证，揭示VvCYP707As 的功能特征。旨在通过对VvCYP707As 的鉴定和功能分析，进一步了解葡萄果实成熟的调控机制，以期为生物育种提供有效的理论依据，从而促进地区葡萄产业健康发展。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料葡萄品种‘鄞红’和‘甬早红’采摘自中国浙江宁波镇海（121°32'E，29°59'N）。ABA胁迫以果园内初始生长状况一致的五年生‘鄞红’葡萄植株9 株为材料。瞬时表达实验以‘鄞红’转色期果实为材料。

1.2 方法

1.2.1 VvCYP707A 家族鉴定 为了从葡萄基因组数据库（http://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-55/gff3/vitis_vinifera/）中鉴定 出VvCYP707A 基 因，使用NCBI 中的苹果和拟南芥等物种的36 个CYP707A 蛋白作为查询序列，利用Blastp，筛选出相似度超过50%的序列，删除序列过短的蛋白。使用circos 绘制基因共线性图。

1.2.2 VvCYP707A 蛋白分析 利用ExPASy software（http://web.expasy.org/protparam/）预测VvCYP707 蛋白的等电点和分子量。利用葡萄数据库中的定位信息，使用TBtools 对VvCYP707A 基因在葡萄染色体上的位置进行可视化。使用在线网站ProtComp（ProtComp -Predict the sub-cellular localization for Plant proteins（softberry.com））对5 个CYP707A 蛋白进行亚细胞定位预测分析。

1.2.3 VvCYP707 家族的系统进化分析 使用默认参数的ClustalW 对27 个CYP707A 蛋白质进行多序列比对。采用MEGA 7.0 软件，根据邻接法构建无根系统发育树，自展值为1 000。使用MEME（MEME-MEME Suite（meme-suite.org））分析motif 结构，使用GSDS（Gene Structure Display Server 2.0（gao-lab.org））分析基因结构。

1.2.4 VvCYP707A 基因启动子顺式元件的鉴定 提取AtCYP07A 和VvCYP707A 转录起始位点上游1.5 kb 序列，通过PlantCARE 网站（PlantCARE,a database of plant promoters and their cis-acting regulatory elements（ugent.be））分析顺式元件。

1.2.5 VvCYP707A 基因表达模式分析 ‘鄞红’为葡萄中熟品种，自开花到果实成熟约为90 d，‘甬早红’由‘鄞红’辐射突变而来，转色时间较‘鄞红’短，上色快，自开花到果实成熟约为75 d，为葡萄早熟品种［15］。分别采摘‘甬早红’和‘鄞红’不同发育时期果实、‘鄞红’叶片和‘鄞红’茎。其中，‘甬早红’自开花后每隔15 d 采取样品一次，‘鄞红’自开花后每隔15 d 采取样品一次，第5 次采样与第4 次间隔30 d。共5 个时期，S1-S2 为幼果期，S3-S5 分别为膨大期、转色期和成熟期。每个发育阶段至少收集3 个样本，果实一部分用来测定果实的理化性质，另一部分放入液氮中速冻，用于 RNA提取。

1.2.6 ABA 胁迫处理 选取果园内初始生长状况一致的五年生‘鄞红’葡萄植株9 株为材料，以施加清水组别为对照组，在转色期的‘鄞红’果实表面施加500 mg/L的外源ABA进行激素处理，在5 min，2、4、6、8 h 五个时间点随机采集3 串果实样本。所有样品用液氮冷冻，并在80℃保存，用于RNA 提取。

1.2.7 VvCYP707A 过表达载体的构建与瞬时表达 采用双酶切技术构建过表达载体，首先扩增Vitvi07g01751 基因的全长编码序列，并将其插入到35S-3xFLAG-1300 载体中构建过表达载体35S:VvCYP707A，相关引物序列见表1，分别将携带空载体和目的基因的重组质粒转化农杆菌GV3101，并注射到葡萄转色期果实中，注射后的果实在正常条件下暗培养48 h 后，测定果实基因表达量和糖含量。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.8 果实品质理化指标测定 随机挑选不同发育时期的果实各20 颗，电子天平（赛恩施，苏州）测定果实重量，计算平均单果质量。指针式水果硬度计（艾德堡，中国）测定果实硬度，10 次重复并记录。蒽酮硫酸比色法测定可溶性糖含量［16］，3 次重复。

1.2.9 RNA 提取与RT-qPCR 检测 采用南京诺唯赞公司的RNA 提取试剂盒提取总RNA，使用上海近岸公司反转录试剂盒获得cDNA 第一条链，上海近岸公司的SYBR qPCR Super Mix Plus 在Bio-Rad CFX96（Bio-Rad，美国）仪器上测定VvCYP707As的Ct 值，并以葡萄Actin 基因为内参基因［17］，使用2-ΔΔCt法计算相对基因表达量［18］。其中，表达模式分析以S1 为对照组；外源ABA 处理下以施加清水的组别为对照组。RT-qPCR 所用引物见表2。

表2 RT-qPCR 所用引物Table 2 Primers for RT-qPCR

1.2.10 数据统计 使用SPSS、Origin、GraphPad 和TBtools 等软件对数据进行处理和绘图。

2 结果

2.1 葡萄VvCYP707A基因家族的鉴定及其蛋白分析

葡萄CYP707A 家族含有5 个成员，分别位于第2、3、6、7 和18 号染色体上（图1-C）；蛋白分析如表3 所示，它们编码氨基酸序列一致性达70.60%，且氨基酸长度和分子量相近（447-488 aa，50 689.3-55 496.0 kD），为碱性蛋白（pI＞9）；亚细胞定位预测位于内质网；均含有血红素铁配位半胱氨酸残基（PFGNGVHSCPG；图1-A），说明葡萄CYP707A 家族高度保守。此外，共线性分析发现，Vitvi02g01269、Vitvi07g01751 和Vitvi18g00792 发 生了片段复制（图1-B）。

图1 葡萄CYP707A 基因家族氨基酸比对（A）、共线性分析（B）与染色体定位（C）Fig.1 Amino acid alignment（A）,collinearity analysis（B）and chromosome localization（C）of grape CYP707A gene family

表3 葡萄CYP707A 蛋白相关信息Table 3 Information of CYP707A proteins in grape

2.2 葡萄VvCYP707A家族系统发育、基因结构和保守motif分析

从8 个物种中筛选出24 条同源性较高的CYP707A 序列，通过MEGA X 建立系统发育树（图2）。24 条蛋白可分为4 组，其中Vitvi02g01269 属于 第1 组，Vitvi06g00498 属于第2 组，其他3 个蛋白均属于第4 组。每组都含有单子叶和双子叶的CYP707A 蛋白，这表明该基因家族的起源先于单子叶和双子叶植物的分化。

图2 CYP707A 蛋白的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree analysis of CYP707A protein

为了更好地分析葡萄CYP707A 蛋白的进化关 系，进一步 分析了4 个AtCYP707As 和5 个VvCYP707As 的系统发育树、基因结构和保守基序（图3）。将结果分为3 个分支，分别命名为Clade I、Clade II 和Clade III（图3-A）。Clade III 包含了3 个片段复制的VvCYP707A 蛋白（Vitvi02g01269、Vitvi07g01751 和Vitvi18g00792）。系统发育分析也显示Vitvi06g00498 与AtCYP707A2 蛋白具有较高的同源性。从葡萄和拟南芥CYP707As 的基因结构可以发现，AtCYP707A 和VvCYP707A 基因的外显子数量保守，在6-9 个之间（图3-B）。Clade I 和Clade II 具有相同的基因结构，均含有两个UTR 区域。Clade III 成员有0-2 个UTR 区域。各种内含子和外显子的多样性表明，VvCYP707As 中可能的替代剪接，对发育和应激反应至关重要。

图3 拟南芥和葡萄CYP707As 的系统发育关系（A）、基因结构（B）及保守基序分析（C）Fig.3 Phylogenetic relationships (A),gene structure (B)and conserved motif analyses (C) of CYP707As from Arabidopsis and V.vinifera

为了进一步分析CYP707A 蛋白结构多样性，利用MEME 分析motif（图3-C）。有些motif 特异性存在于某些演化之中。例如，motif 9 只出现在Clade II中，motif 10 出现在Clade I 中。总之，进化树中进化关系密切的CYP707A 蛋白的基因结构基本相似，motif 保守，说明两个不同物种中每个亚家族的进化相对保守。

2.3 葡萄中VvCYP707A基因启动子的顺式元件鉴定

利用PlantCARE 在AtCYP707A 和VvCYP707A 基因上游1.5 kb 启动子区域鉴定了潜在的顺式元件。已鉴定的顺式调控元件可分为3 个功能群，即生长发育相关、应激和激素元件。结果（图4）显示，在所有的VvCYP707As 基因启动子中都发现了与应激和激素反应相关的顺式元件；与应激相关的元件主要集中于MYB 和MYC；与激素相关的元件主要集中于参与ABA 反应的ABRE、MeJA 反应的CGTCAmotif 和乙烯反应的ERE。葡萄的CYP707A 启动子比拟南芥CYP707A 启动子拥有更多的与生长发育相关的顺式作用元件，这可能与VvCYP707A 长期进化形成特有功能相关。其中，Vitvi06g00498 基因启动子中与激素反应相关的顺式元件数量最多，ABRE元件数量拥有8 个，可能该基因对ABA 反应较为敏感；Vitvi03g00508 基因启动子中与激素反应相关的顺式元件数量较少，只有一个ERE 顺式元件。

图4 拟南芥和葡萄CYP707As 基因启动子顺式作用元件Fig.4 Cis-acting elements of AtCYP707As and VvCYP707As gene promotors in Arabidopsis and V.vinifera

2.4 葡萄VvCYP707A在不同葡萄品种果实中的表达模式

采取‘鄞红’和‘甬早红’两个品种5 个时期的果实，测定其理化性质（图5-A-D），从中可以观察到‘甬早红’的单果重、硬度和可溶性糖发育模式与‘鄞红’基本一致，‘甬早红’果实单重和可溶性糖含量都低于‘鄞红’；硬度在转色期时差异显著。

图5 两种葡萄果实发育的生理参数及VvCYP707As 基因相对表达量Fig.5 Physiological parameters and VvCYP707As related expression related to fruit development in two kinds of V.vinifera

5 个VvCYP707As 基因在两个品种的果实的相对表达量如图5-E 所示。除Vitvi18g00792 在两个品种表达量无明显差异外，其余的4 个VvCYP707As 基因在‘甬早红’表达量均高于 ‘鄞红’；Vitvi02g01269、Vitvi06g00498 和Vitvi18g00792 在两个品种中各自具有相似的表达趋势，即表达量与时期紧密相关。Vitvi07g01751 在‘甬早红’和‘鄞红’中表达量差异极为显著，在S3 时期表达量差异甚至高达77.93倍。推测Vitvi07g01751 的高表达是导致 ‘甬早红’成熟期提前的关键基因，同时导致其可溶性糖含量下降和硬度增加。

2.5 葡萄VvCYP707As在‘鄞红’不同组织与不同时期的表达模式

VvCYP707As 在‘鄞红’葡萄发育时的组织特异性如图6 所示，以各个组织的S1 期为对照组。在果肉中（图6-A），表达模式可以分为两类，Vitvi07g01751和Vitvi18g00792具有相似的表达模式，几乎在果实发育整个时期都发挥作用，在S5 时期表达下降；同样身为片段复制的Vitvi02g01269 却属于第二类，随着果实发育而增加，在S4 转色期表达下调。在果皮中（图6-B），VvCYP707As 基因在幼果期与膨大期均较高表达，在S4 转色期同样的表达下调。在转色期不同组织中（图6-C），Vitvi02g01269和Vitvi07g01751 在茎和叶中表达显著大于果肉和果皮组织，其余VvCYP707As 在4 个组织中无显著差异。VvCYP707As 主要在茎和叶组织中高表达。

图6 VvCYP707As 在‘鄞红’不同组织不同时期表达模式Fig.6 VvCYP707As expression patterns in different tissues and different periods in ‘Yin Hong’

2.6 葡萄VvCYP707As在外源ABA处理下的表达特性

为探究VvCYP707As 是否受外源ABA 诱导影响，采用外源ABA 喷施葡萄果实表面。VvCYP707As对外源ABA 在果皮和果肉中表现出不同的反应模式，与施加清水的对照组相比，ABA 处理后5 min内，葡萄果皮中Vitvi18g00792 表达量上升，其余VvCYP707As 基因表达量下降，说明ABA 处理显著抑制了果皮中 VvCYP707As 的表达，随后趋于稳定（图7-A）。然而，在ABA 处理的浆果肉中（图7-B），VvCYP707As 会受到ABA 的强烈诱导，在处理后2-4 h 后波动较大，尤其是Vitvi02g01269和Vitvi03g00508，在ABA 处理后2 h 分别被诱导上调表达28.36 倍和45.46 倍，但在4 h 时显著下降；而Vitvi07g01751 在2 h 和4 h 持续高表达；Vitvi18g00792反应敏感，在ABA处理1 h后达到峰值，2-4 h 表达下降，与对照组浆果肉表达量无显著差异。

图7 葡萄果皮（A）和果肉（B）VvCYP707As 基因在ABA 处理下相对表达量Fig.7 Relative expressions of VvCYP707As gene in grape pericarp（A）and grape flesh（B）under ABA treatment

2.7 葡萄VvCYP707As基因瞬时表达分析

Vitvi07g01751 基因表达量在‘鄞红’和‘甬早红’葡萄果实中差异显著，推测其在葡萄成熟过程中发挥关键作用。将构建好的携带Vitvi07g01751 基因的重组质粒注射到转色期的‘鄞红’果实进行瞬时表达，48 h 后测定基因表达量和HPLC 法测定葡萄糖和果糖。结果（图8-A）显示，对Vitvi07g01751 基因瞬时表达量进行RT-qPCR 分析，Vitvi07g01751 基因在35S:VvCYP707A 果实中表达量最高，并且与其他3 组具有显著差异。过表达Vitvi07g01751 的果糖与对照组和空载35S 无显著差异；35S:VvCYP707A葡萄糖显著小于对照和35S 组，与2 d 前对照无显著差异，影响了葡萄糖的积累；对葡萄6 个PYL 基因进行RT-qPCR 检测（图8-B）。对照组、35S 和35S:VvCYP707A 组的VvPYL3/5/6 都与2 d 前对照组具有显著差异，推测是葡萄自然发育影响了基因的表达量；35S 和35S:VvCYP707A 组的VvPYL1 较对照组有显著差异可能是注射创口影响；VvPYL2 在4 个组别中无显著差异；VvPYL4 在过表达Vitvi07g01751表达量变化极其显著，说明Vitvi07g01751 的变化能影响VvPYL4 的表达。

图8 瞬时表达相关基因RT-qPCR 检测与理化测定Fig.8 Transient expression related genes were detected by RT-qPCR and determination of fruit sugar

3 讨论

CYP707A 基因参与调控植物激素信号转导和生长发育等过程［14,19］。在大多数的实验中，过表达CYP707A 会造成植株生长缓慢［20］，而桃CYP707A转入拟南芥中，在低温环境下却促进植株生长［21］。目前，葡萄CYP707A 的相关研究较少，本研究通过多物种CYP707A 蛋白结构域分析比对共鉴定出5 个葡萄CYP707A 家族成员。研究基因结构和保守motif 的差异，是分析基因家族进化关系的重要参考。CYP 家族是一个保守的大家族［22］，在本研究中，对VvCYP707A 多序列比对分析显示，5 个CYP707A 基因都含有保守的P450 半胱氨酸血红素铁配位体，这是8'羟化酶催化活性的必须结构［10］。系统发育树分析表明，CYP707A 蛋白在不同物种间具有高度的序列保守性，并且Vitvi18g00792 与CsCYP707A4 蛋白亲缘关系较近，Vitvi03g00508 和Vitvi06g00498 与MdCYP707A 蛋白亲缘关系较近，意味着葡萄的VvCYP707A 蛋白与苹果和柑橘的亲缘关系更近。通过对VvCYP707A 的基因结构分析，除Vitvi03g00508 和Vitvi07g01751 外，都含有2 个UTR区，且蛋白motif 保守。VvCYP707A 基因启动子序列含有大量应激及激素相关的顺式作用元件，且相较于AtCYP707A 有着更多的与生长发育相关的作用元件，可能这与VvCYP707A 参与果实成熟功能有关。

ABA8'羟化酶是催化ABA 降解的关键酶，参与了调节ABA 稳态的过程。基因重复是基因家族产生和扩张的主要原因，基因复制影响了植物物种间的基因功能的多样性［23］，在本研究中，Vitvi02g01269、Vitvi07g01751 和Vitvi18g00792 三 个发生片段复制的CYP707A 基因均在葡萄不同组织中表达，但表达模式存在差异，具有组织特异性和时空特异性，表明了VvCYP707A 在葡萄不同组织中参与了ABA 积累的调控。在葡萄果实中，大部分的VvCYP707As 随着果实发育呈现表达下降的趋势，仅有Vitvi07g01751 在‘甬早红’果实膨大期表达显著上升，推测该基因的特异性高表达可能是影响葡萄成熟期提前的关键因素之一，猕猴桃（Actinidia chinensis）CYP707A3 也有类似的发现［24］。此外，研究表明施加外源ABA 会促进葡萄着色［25］，而内源ABA 含量随着葡萄果实发育而不断积累至转色期达到峰值［26］。本实验中，葡萄果皮中的CYP707As 在转色期S4 下调表达，推测内源ABA 不断积累从而促进了果实着色。

ABA 作为一种植物化学信号分子，已有报道表明植物受到外源ABA 处理后，与ABA 合成和分解的基因受其诱导调节［27］。其中，研究证实拟南芥和桃子CYP707A 基因家族可以被ABA 诱导［28-29］。本研究中，葡萄CYP707A 启动子区域都含有ABA 响应元件，且ABA 处理下，5 个VvCYP707A 都能进行响应，验证了顺式作用元件预测的可靠性，并且反应迅速的VvCYP707A 都含有ERE 顺式作用元件，可能是由于施加外源ABA 后果实通过上调乙烯合成相关基因导致反应敏感［30］。这些结果为进一步研究VvCYP707As 基因在果实成熟中的功能和阐明其机制提供了基础。

转色期是葡萄成熟并积累糖的关键时期［31］，在S4 时期，几乎所有的VvCYP707As 都下调了表达，然而‘甬早红’的可溶性糖含量在该时期并未增加太多且与‘鄞红’的可溶性糖差异极为显著，可能是由于‘甬早红’的VvCYP707As 普遍表达量高所导致的。研究表明，CYP707A 会影响ABA 受体PYL 的表达［7］，将两个品种中表达差异显著的Vitvi07g01751 瞬时过表达后，葡萄的糖度积累减慢，同时也极大程度影响了VvPYL4 的表达。推测‘甬早红’的早熟是由于在S3 时期Vitvi07g01751 的高表达，造成了PYL 的上升，当VvCYP707As 下调表达时，ABA 得到积累，受体的增加导致植株能更好地对ABA 做出变化，从而造成葡萄早熟的现象。然而时间有限，本文尚未对Vitvi07g01751 的稳态转化做出研究。

4 结论

CYP707A 基因家族成员相对保守，但在进化中可能发生了功能分化。通过对比‘鄞红’和‘甬早红’的CYP707As 在果实发育时期的表达变化发现，Vitvi07g01751 在两个品种中差异表达，将其瞬时表达后能极大程度影响VvPYL4 的表达，并减少糖的积累；在成熟过程中发挥着重大作用并影响葡萄果实品质，这对后续葡萄的成熟基因挖掘和性状改良具有一定的意义。