基于流式细胞仪鉴定番石榴倍性方法的建立及应用

邵雪花 李桂兰 肖维强 赖多 庄庆礼 秦健

（1.广东省农业科学院果树研究所 农业农村部南亚热带果树生物学与遗传资源利用重点实验室 广东省热带亚热带果树研究重点实验室，广州 510640；2.长江大学园艺园林学院，荆州 434000）

番石榴（Psidium guajava Linn.）别名芭乐、鸡矢果等，系桃金娘科（Myrtaceae）番石榴属（Psidium），原产于南美洲，现广泛分布于热带和亚热带地区［1］。番石榴果实芳香、甘甜，具有很高的营养价值［2］。另外，长期以来民间用其叶做茶，对腹泻、糖尿病、口腔溃疡等均有一定的治疗效果［3-5］。经药理研究证实，番石榴富含酚类、黄酮类、萜类、多糖等生物活性物质，具有抗氧化、护肝、抗菌、抗糖尿病、抗炎和抗癌活性［1,6-8］。正因为番石榴的食用和药用价值高，2019 年全球番石榴产量就已达5 585 万t［9］。目前，我国福建、广东、广西等地均有大量栽培［10］，其总产量仅次于印度，排名世界第二［2］。然而，当前我国番石榴主栽品种单一，品种资源匮乏，不利于我国的番石榴产业发展，因此，选育出更多的番石榴新品种刻不容缓。

对于植物的育性研究和新品种选育工作而言，其染色体的倍性鉴定尤为重要［11］。流式细胞术是一种利用流式细胞仪快速多次参数分析流体中单个细胞的技术［12］。近年来，流式细胞术因其操作技术简单、用时短、效率高、鉴定结果准确等优点，被普遍用于检测植物的基因组大小和染色体倍性，如马铃薯［13］、大豆［14］、菊芋［15］和棉花［16］等。目前，有关番石榴倍性的研究尚未见报道，严重限制了番石榴的倍性育种和杂交育种工作。本研究通过比较离心处理、样本部位和保存方式等对番石榴倍性鉴定效果的影响，建立基于流式细胞术的番石榴倍性鉴定方法，并用该方法对33 种番石榴种质资源进行倍性鉴定，旨为后续番石榴倍性鉴定以及推动番石榴育种工作奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料 33 份番石榴种质资源的嫩叶、花瓣、芽均采自于广东省农科院果树研究所优稀水果研究室番石榴资源圃。

1.1.2 试剂及仪器设备 mGb 解离液购自南京博巧生物科技有限公司、碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液购自北京索莱宝科技有限公司、BD FACSVerse 流式细胞仪购自上海土森视觉科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 流式细胞术方法的建立

1.2.1.1 样本部位的选择 分别取番石榴嫩叶、芽、花瓣，按照以下方法进行处理，比较不同组织提取细胞核的含量。每个处理重复3 次。

处理方法：取0.50-1.00 cm2待测样本，置于培养皿中，加入1 mL 预冷的mGb 解离液，使待测样品完全浸没在解离液中。使用刀片垂直快速切碎样品，此过程尽量将待测样品浸没于解离液中，静置1 min 以获取完整的细胞核。吸取培养皿内的混合溶液，用400 目滤膜将悬浊液过滤至流式管内，再加入30 μL 预冷的PI 染料，混匀后4℃避光染色10 min。最后使用流式细胞仪上机检测，以二倍体番石榴品种‘珍珠’细胞组织的DNA 含量作为参照，每次检测收集约100 000 个细胞，以CV 值（DNA 含量峰值的变异系数）的大小作为评价流式测定结果的参数。用FlowJo 软件进行数据分析。

1.2.1.2 离心方案的优化 分别取0.50-1.00 cm2待测样本，加入1 mL 预冷的mGb 解离液，快速切碎后用400 目滤膜将悬浊液过滤至1.50 mL 离心管中。4℃离心后去上清，保留200 μL 沉淀，分别加入预冷后的100 μL 解离液和30 μL PI 染料，混匀后4℃避光染色10 min，上机检测。共设置4 个处理，分别 为：1 000 r/min 离 心5 min（L1），1 000 r/min 离心10 min（L2），2 000 r/min 离 心5 min（L3）和2 000 r/min 离心10 min（L4），以未离心组作为对照（CK）组。每个处理重复3 次。

1.2.1.3 样本保存方式的比较 按照1.2.1 的处理方法，选取新鲜样本作为对照（CK）组，冷藏（4℃）和冷冻（-20℃、-40℃、-80℃）4 种保存方式（均保存7 d）的花瓣，比较不同温度处理后花瓣的细胞核含量。每个处理重复3 次。

1.2.2 番石榴种质资源倍性鉴定 取33 份番石榴种质资源的新鲜花瓣，采用建立的流式细胞术方法对其倍性进行检测。

1.2.3 数据统计 采用FlowJo 软件分析细胞流式数据。以CV 值（DNA 含量峰值的变异系数）的大小作为评价结果好坏的参数。

2 结果

2.1 样本检测组织的确定

本文分别取番石榴的嫩叶、芽和花瓣进行测定。结果（图1）表明，花瓣作为检测部位时收集到的细胞核数目最多，CV 值为1.96%，峰形效果最佳，噪音峰小且主峰明显；嫩叶作为检测部位时峰形效果次之，有噪音峰，碎片增多，CV 值为2.32%；芽作为检测部位时可检测到的细胞核数目明显减少，杂峰较多，噪音峰干扰大，主峰不清晰。综上表明，番石榴的花瓣更适宜作为倍性检测的材料。

图1 番石榴不同组织流式图Fig.1 Flow chart of different tissues of guava

2.2 离心方案的确定

以番石榴花瓣为材料，将获得的细胞核悬浮液分别设置不同离心转速和离心时间。番石榴花瓣的细胞核相对DNA 含量结果如图2 所示，CK 组获得的细胞核DNA 含量最多且染色均匀，相对荧光强度集中，噪音峰少，主峰明显，CV 值为1.97%；而离心后则导致细胞核DNA 大量损失，收集到的细胞碎片较多，主峰周围噪音增多，无法形成明显的主峰；L1 和L3 组由于离心时间过短，细胞碎片没有得到有效分离，CV 值低于其他处理组；L2 组1 000 r/min离心10 min，荧光强度较为集中，获得的细胞数量较多，CV 值为1.96%，在离心处理组中表现最好；L4 组2 000 r/min 离心10 min 后收集的样本细胞数量较少，峰值降低明显。因此，在制备细胞核悬浮液时，过滤后无需离心，染色后直接上机测定效果最佳。

图2 番石榴不同离心方式的比较Fig.2 Comparison of different centrifugation methods of guava

2.3 样本保存方式的确定

取不经低温保存的新鲜番石榴花瓣作对照（CK）组，冷藏（4℃）和冷冻（-20℃、-40℃和-80℃）保存方式对番石榴花瓣各保存7 d 后进行测定。结果（图3）表明，CK 组的检测效果最好，收集到的细胞核DNA 含量最高，CV 值为1.96%，背景碎片少，主峰明显；冷藏和各级冷冻处理下，只有-80℃冷冻处理对样本的破坏性最小，获取的细胞核DNA 含量明显高于其他组，CV 值为1.88%，主峰明显，但与对照组相比有少量偏锋；冷藏（4℃）处理后，主峰较好，噪音峰少，但细胞核DNA 含量较低，CV 值升高为2.04%；-20℃和-40℃冷冻处理后造成峰图噪音峰明显增多，杂峰较多，收集到的细胞核DNA含量较低。综上可见，新鲜番石榴花瓣染色后直接上机测定效果最佳。

图3 番石榴不同保存温度流式图Fig.3 Flow diagram of different storage temperatures of P.guajava

2.4 流式细胞术鉴定番石榴倍性的方法

利用建立的流式细胞术分析方法，对33 份试验样本进行处理后上机检测（图4），其中纵坐标轴代表测定细胞数的相对值，横坐标轴代表荧光的通道值，峰值的位置反应的是测试样品的倍性，若峰值在50 左右，判定该品种为二倍体，峰值在100 左右，判定该品种为四倍体，峰值在150 左右，则判定该品种为六倍体。

图4 不同倍性番石榴花瓣的相对DNA 含量Fig.4 Relative DNA contents of P.guajava petals with different ploidy levels

2.5 番石榴种质资源倍性鉴定

在本研究中，以已知的二倍体番石榴品种‘珍珠’做参照，采用流式细胞术对33 种番石榴树种资源进行倍性鉴定，结果如表1 可得，变异系数CV 值（DNA含量峰值的变异系数）为1.68%-2.36%。其中，‘草莓’番石榴判断为六倍体，其余32 份样品（包括‘帝王’‘水蜜’‘金斗香’‘翡翠’‘紫果’等番石榴种质资源）均为二倍体，倍性系数介于0.42-0.59，倍性估算值为1.68-2.36。

3 讨论

倍性分析是研究遗传进化、开展倍性育种和杂交育种工作的基础［11］。目前，流式细胞术因其制样简单、灵敏度高和准确性高等优点已成为鉴定植物倍性的首选方法［17］。然而，对于不同植物而言，采用不同组织部位、离心漂洗方式、保存温度等均会影响倍性鉴定的结果可靠性［18-19］。

根据其他植物材料已有的研究报道，植物材料选取不当，会造成细胞核颗粒提取不足且杂质较多，影响倍性检测效果。例如，赵孟良等［15］比较菊芋块茎、根、老叶和嫩叶的倍性检测效果发现，嫩叶是其倍性鉴定的理想材料；王娅丽等［16］发现以棉花嫩叶作为检测材料的倍性鉴定效果优于老叶。本研究发现，花瓣作为检测材料时荧光信号集中，受到的干扰最少，峰形效果最好；嫩叶作为测试材料时荧光信号较为集中，有少量干扰但不影响峰形判断，效果次之；芽作为测试材料时荧光信号比较分散，主峰前后都有干扰增多，峰形效果差；故推荐番石榴花瓣作为其倍性鉴定的首选材料。

离心漂洗常被用于减少细胞核悬浮液的杂质成分对结果的干扰，但因植物材料不同导致离心的转速及时间存在差异。例如，张桂芳等［20］比较不同离心时间对铁皮石斛倍性检测效果的影响，认为2 000 r/min 离心8 min 效果最佳；杨静等［21］对桑树的研究表明，不离心与离心漂洗1-2 次对其倍性检测效果无差异。本研究中，离心处理后的番石榴细胞核悬浮液峰图质量差，原因可能是细胞核DNA 链断裂，导致碎片增加和荧光信号分散，因此番石榴细胞核悬浮液直接经400 目滤膜过滤后即可染色测定，无需离心，可显著缩短样品的制备时间，并提高其测定效率。

在收集野外番石榴资源，利用流式细胞术鉴定其染色体倍性时，从采集到实验室测定的过程中，往往无法实现样品即采即测，因此保存样本以确保细胞悬浮液的有效制备对其倍性鉴定至关重要［21］。目前，对于部分无法在数日内检测的样本，低温保存是植物倍性鉴定样本保存的最常用方式［21-22］。本研究结果表明，新鲜番石榴花瓣得到的细胞核悬浮液最好，其次为-80℃冷冻处理组，该处理对样本的破坏性最小，获取的细胞核DNA 含量明显高于冷藏和其他冷冻处理组，且主峰明显，效果较好。冷藏（4℃）处理后会导致细胞核DNA 含量降低，而-20℃和-40℃保存，可能是因为冷冻造成番石榴花瓣组织中产生过多细胞碎片，虽不影响倍性鉴定正确性，但杂峰较多，效果不佳。

CV 值是判断倍性检测结果可靠与否的关键指标。Georgiev 等［23］认为，流式细胞仪检测的CV 值在9.00%以内，其检测结果就比较可靠。吕顺等［17］也认为，对于含有较多酚类物质的植物，CV 值＜10.00%可达到理想结果。本研究采用优化的流式细胞术对33 份番石榴种质资源进行倍性鉴定，测定CV 值低于2.36%，表明优化的流式细胞术可以确保番石榴倍性鉴定结果的准确性。

4 结论

本研究建立了番石榴种质资源流式细胞术鉴定其倍性的方法，该方法检测条件为：选取番石榴新鲜花瓣或-80℃冷冻保存的花瓣，加入1 mL 的mGb裂解液中混合切碎，400 目滤膜过滤后加入30 μL PI 染色1 min 即可上机检测。33 份番石榴种质资源倍性整体变异系数为1.68%-2.36%，二倍体32 份，六倍体1 份。该体系的建立及番石榴种质资源倍性的明确对下一步番石榴倍性育种和杂交育种奠定了基础。