右美托咪定对IL-1β诱导的人髓核细胞凋亡和炎症反应的影响

王磊，吴海龙，张金强

中国人民解放军火箭军特色医学中心麻醉科，北京 102209

椎间盘退变是慢性腰痛的常见原因，主要原因为髓核长期慢性劳损、反复外力刺激，导致髓核水分流失严重，进而出现变性改变，临床表现为腰背部或颈部疼痛、感觉异常及活动障碍等［1］。椎间盘受损后易引起形态学改变，有研究显示，炎性微环境改变是椎间盘疼痛的主要原因，而白细胞介素1β（IL-1β）诱导的髓核细胞损伤是其主要病理特征，进而介导椎间盘髓核细胞再生、衰老、凋亡和炎症反应等过程，加速疾病进展［2-3］。右美托咪定（Dex）是临床常用的麻醉药，具有镇静镇痛、抑制术后应激反应等作用，现阶段主要用于麻醉诱导、急危重症镇痛、减少术后躁动等［4］。有研究发现，Dex通过调节磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸-苏氨酸激酶通路可减轻IL-1β诱导的软骨细胞凋亡、外基质降解和炎症损伤［5］。但有关Dex 对IL-1β 诱导的髓核细胞损伤的影响尚不清楚。2021 年10 月—2022 年11 月本研究通过建立体外细胞模型模拟椎间盘退变，以探究Dex 对IL-1β诱导的髓核细胞凋亡和炎症反应的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人髓核细胞购自武汉赛奥斯生物科技有限公司；胎牛血清、杜氏改良依格尔培养基（DMEM）培养基购自美国Gibo公司；Dex购自江苏恒瑞医药股份有限公司；外源性IL-1β 购自美国Sigma公司；噻唑蓝（MTT）试剂盒、凋亡试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；肿瘤坏死因子α（TNF-α）、IL-8、IL-6 试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司；一氧化氮（NO）试剂盒购自上海科艾博生物科技有限公司；B 细胞淋巴瘤/白血病2（Bcl-2）抗体、诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）抗体、Bcl-2 相关X 蛋白（Bax）抗体、环氧化酶2（COX-2）抗体购自英国Abcam 公司；二喹啉甲酸（BCA）试剂盒、电化学发光（ECL）试剂购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 细胞培养 将人髓核细胞于恒温水浴锅中解冻，复苏后，将细胞加至含有10% 胎牛血清的DMEM 培养基中，于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养；细胞生长融合至90%，加胰酶消化传代培养；取第3～5代细胞进行实验。

1.3 细胞分组及干预 将生长良好的髓核细胞随机分为对照组（Control 组）、IL-1β 组、IL-1β+Dex-L组、IL-1β+Dex-M 组、IL-1β+Dex-H 组。Control 组不做任何处理，其他组依次给予10 ng/mL IL-1β、10 ng/mL IL-1β+25 nmol/L Dex、10 ng/mL IL-1β+50 nmol/L Dex、10 ng/mL IL-1β+100 nmol/L Dex，继续培养24 h。

1.4 细胞存活率检测 采用MTT 法。收集各组细胞并将其接种96孔板中，每孔100 μL，培养24、48 h，加MTT 试剂20 μL，继续培养4 h，弃培养液，加150 μL 的二甲基亚砜试剂，结晶完全溶解后，用酶标仪检测波长490 nm 处的吸光度值（OD 值），细胞存活率=实验组OD值/对照组OD值×100%。

1.5 细胞凋亡率检测 采用流式细胞术。收集各组细胞，用预冷缓冲液洗涤细胞，并调整至1×105/mL。取100 μL细胞悬液，加磷脂结合蛋白V FITC和碘化丙啶各5 μL，避光孵育15 min，继续加400 μL 细胞悬液，上流式细胞仪检测细胞凋亡情况，细胞凋亡率（%）=（早期凋亡数+晚期凋亡数）/细胞总数×100%。

1.6 TNF-α、IL-8、NO、IL-6 检测 采用酶联免疫吸附法。取各组细胞，4 ℃下4 000 r/min 离心8 min（离心半径12 cm）后取细胞上清液，按照试剂盒操作说明检测TNF-α、IL-8、NO、IL-6因子表达。

1.7 Bcl-2、Bax、iNOS、COX-2 蛋白检测 采用Western blotting 法。检测收集各组细胞，用蛋白裂解液提取总蛋白，经BCA 法检测定量后，将50 μg上样蛋白通过电泳分离后转移至硝酸纤维素膜上，加5%脱脂奶粉封闭培养120 min，与Bcl-2、Bax、iNOS、COX-2 一抗在4℃下过夜孵育，次日与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗室温孵育120 min。最后加ECL 试剂显影，ImageJ 软件分析蛋白条带灰度值。

1.8 统计学分析 采用SPSS26.0 统计软件。服从正态分布计量资料以-x±s表示，多组间比较用单因素方差分析，进一步两两比较行LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Dex 对IL-1β 诱导后髓核细胞存活率的影响 见表1。

表1 各组培养不同时间细胞存活率比较（%，-x ± s）

2.2 Dex 对IL-1β 诱导后髓核细胞凋亡的影响 见表2。

表2 各组细胞凋亡率及凋亡相关蛋白表达比较（-x ± s）

2.3 Dex 对IL-1β 诱导后髓核细胞炎症反应的影响 见表3。

表3 各组细胞上清液中炎症因子水平比较（pg/mL，-x ± s）

2.4 Dex 对IL-1β 诱导后髓核细胞中COX-2、iNOS蛋白表达及上清液中NO水平的影响 见表4。

表4 各组细胞中COX-2、iNOS蛋白表达及上清液中NO水平比较（-x ± s）

3 讨论

研究显示，约40%椎间盘退变患者会出现下腰痛，而10%患者长期处于残疾状态。椎间盘主要由中间凝胶状的髓核细胞及包绕周围的11～15层同心纤维层组成，通过软骨终板与上下椎体相互连接，三者之间共同构成人体脊柱的基本缓冲和承重单元［6-7］。当椎间盘发生退变时，可引起椎间盘髓核细胞中释放大量炎症因子，如IL-1β、TNF-α、IL-8 等［8］，激烈炎症反应可诱导髓核细胞合成能力减弱，促进细胞凋亡，导致髓核细胞过度病变，最终加速椎间盘退变［9-10］。髓核细胞含有丰富蛋白多糖、水分和Ⅱ型胶原，其保水能力对抵抗脊柱压缩轴向力至关重要，并维持椎间盘正常高度。已有研究证明，髓核细胞代谢失衡、凋亡和炎症反应等与椎间盘退变密切相关［11］。IL-1β是生物体常见细胞因子，几乎所有核细胞中都能合成IL-1β，其主要来源于活化的单核巨噬细胞和淋巴细胞等，其在免疫调节、炎性反应、化合物代谢调节等方面发挥重要作用，若机体内IL-1β出现失衡，可诱导多种病理生理变化，如脓毒症、关节炎、椎间盘退变等炎性疾病［12-14］。本研究用多功能因子IL-1β处理髓核细胞以建立椎间盘退变体外模型，且多数研究已证明该细胞模型可成功模拟椎间盘退变［15-16］。本研究显示，IL-1β可减弱细胞存活，并加速细胞凋亡，这与杨利斌等［16］研究报道一致，证明模型构建成功。

Dex 属于高效选择性受体激动剂，具有多种功效，除镇静、镇痛作用外，还具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用［17］。YOSHIKAWA 等［18］报道称，Dex 还可通过激活胆碱能的抗炎通路，促进单核巨噬细胞中炎症因子合成，进而抑制全身炎症反应。近年Dex因具有细胞保护作用被广泛关注，其对心脏、肾脏、肝脏及脑等具有保护作用［19］。于芝等［20］在膝骨关节炎中研究发现，Dex 可减轻炎症诱导的人软骨细胞自噬和凋亡。邢丹丹等［21］通过体内动物实验发现，Dex 介导炎症经典信号通路，进而抑制佐剂性膝骨关节炎细胞滑膜样凋亡。但其对椎间盘退变的实验研究还不清楚。本研究发现，采用不同浓度Dex 处理IL-1β 诱导的髓核细胞后，可呈浓度依赖性升高细胞存活率，并降低细胞凋亡率、Bax 蛋白表达，上调Bcl-2蛋白表达。表明Dex 可减轻IL-1β 诱导的髓核细胞凋亡，促进细胞增殖。

研究显示，炎症因子改变与椎间盘退变发展具有重要临床意义，当椎间盘发生病变时，可促进髓核细胞释放较多TNF-α、IL-6 等因子［22］。本研究证实，IL-1β 处理髓核细胞可促进大量炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8 表达，可见，在椎间盘退变过程中，炎症反应中细胞因子增加是其必经过程。持续神经根和脊髓压迫，可激活iNOS产生大量NO，进一步加重受伤区域中iNOS 表达，诱导髓核细胞过度凋亡，加重椎间盘退化［23］。COX-2 是一种炎症反应介质，是炎症因子较为重要的一种，COX-2 可催化生成前列腺素含量，进而减少蛋白多糖含量，以促进椎间盘退变［24］。本研究发现，IL-1β 诱导的髓核细胞可上调COX-2、iNOS蛋白表达，并促进NO合成，经Dex干预后，可降低COX-2、iNOS 蛋白表达，减少NO 合成及TNF-α、IL-6、IL-8 释放，提示Dex 可减轻IL-1β 诱导的髓核细胞炎症反应。

综上所述，Dex 可抑制IL-1β 诱导的髓核细胞凋亡和炎症反应，并促进细胞增殖，有助于延缓椎间盘退变疾病进展。但本研究侧重于体外细胞模型研究，下一步可通过建立椎间盘退变大鼠模型，体内观察Dex 对椎间盘退变大鼠髓核细胞损伤的影响，以验证本结论。