基于HPLC指纹图谱结合化学模式识别对葡萄醋的质量评价

戴丽莉, 李晓娟, 赵翡翠

(1新疆医科大学附属中医医院药学部, 乌鲁木齐 830002; 2新疆维吾尔自治区中药炮制重点实验室, 乌鲁木齐 830000)

葡萄醋是一种以葡萄为主要原料,利用传统压榨发酵技术酿造、富有新疆地域特色的民族药和传统炮制辅料[1-2],具有清热燥湿、退烧、消炎、止泻、解毒、化淤血、止痛、驱虫等功效[3-4],主要用于制备蜜膏剂、合剂、糖浆剂等。新疆地区葡萄资源丰富,但目前为止葡萄醋还没有法定质量标准,其中的特征成分研究基础薄弱,基于葡萄醋方面的药用开发利用受限。因此,本研究收集不同产地15批葡萄醋样品,通过高效液相测定葡萄醋中有机酸成分的含量,建立葡萄醋中有机酸成分指纹图谱[5-7],并结合化学模式识别[8-9]筛选葡萄醋质量差异的标志物,对不同产地葡萄醋的质量进行评价,为临床应用提供参考,同时为制定葡萄醋合理质量控制方法提供研究数据,为后续进一步研究其葡萄醋炮制发酵机制奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器1525型高效液相色谱仪(含2489 型PAD 检测器,Empower Pro 工作站,美国Waters 公司), Centra-20 型紫外-可见分光光度计(GBC 科学仪器有限公司), AG-135 型电子天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司),电热恒温水浴锅(北京永光明医疗仪器有限公司),电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械有限公司)。

1.2 试药酒石酸对照品(批号B25642, 质量分数≥98%)、苹果酸对照品(批号B20524, 质量分数≥98%)、琥珀酸对照品(批号B20534, 质量分数≥98%)、富马酸对照品(批号B20937, 质量分数≥98%)、绿原酸对照品(批号B20132, 质量分数≥98%)、乙酸对照品(批号B20236, 质量分数≥98%)均购于中国食品药品检定研究院;乙腈为色谱纯,其他试剂均为分析纯。15批不同产地的葡萄醋样品,来源于新疆不同地区,见表1。

表1 15批葡萄醋来源信息

2 方法与结果

2.1 葡萄醋中有机酸含量测定方法学考察

2.1.1 色谱条件[10-11]XTerra C18色谱柱( 4.6 mm×250 mm,5 μm);填充剂:十八烷基硅烷键合硅胶;流动相: 甲醇(A)∶0.5%磷酸水溶液(D)=1∶99, 选择紫外光检测器, 检测波长为210 nm, 进样量: 10 μL,理论塔板数不少于5 000。

2.1.2 混合对照品溶液的制备 分别精密称取酒石酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸、绿原酸、乙酸对照品0.1 g,加入超纯水配置成每1 mL含1 mg混合对照品溶液。见图1。

注: 横坐标, 出峰时间; 纵坐标, 峰面积。

2.1.3 供试品溶液的制备 精密量取10 mL葡萄醋和0.25 mL流动相置于分液漏斗中,摇匀,静置5 min,再精密量取15 mL乙酸乙酯加入分液漏斗中,摇匀萃取,静置分层,反复5次,收集上层滤液约75 mL,将滤液旋转蒸发置干,再于蒸干的圆底烧瓶中加入10mL已经滤过的超纯水,静置10 min,再通过0.22 μm的微孔滤膜,即可得到供试品溶液。

2.1.4 精密度试验 取葡萄醋供试品溶液,对照混合对照品溶液,按色谱条件连续进样6次,记录色谱图,分别对共有峰的峰面积比值进行考察,酒石酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸、绿原酸和乙酸的相对标准偏差(RSD)分别为1.31%、1.80%、0.81%、2.65%、3.43%和2.44%(n=6),结果表明仪器精密度良好。

2.1.5 重现性试验 精密量取葡萄醋供试品溶液6份,按制备方法进行制备后进样,记录色谱图,分别对共有峰的峰面积比值进行考察,酒石酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸、绿原酸和乙酸的RSD分别为1.38%、 0.28%、 0.39%、 0.17%、 0.85%和0.30%(n=6),结果表明本方法的重现性较好。

2.1.6 稳定性试验 取葡萄醋供试品溶液,按制备方法进行制备,分别在0,4,8,14,20,24 h进样分析,记录色谱图,分别对共有峰的峰面积比值进行考察,酒石酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸、绿原酸和乙酸的RSD分别为2.86%、1.10%、0.97%、1.13%、0.48%和3.77%(n=6),结果表明供试品溶液在24小时内稳定性良好。

2.1.7 加样回收试验 采用加样回收法,精密量取葡萄醋供试品溶液10 mL,共6份,精密加入每1 mL含酒石酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸、绿原酸、乙酸0.5 mg的对照品的溶液10 mL,按供试品制备方法制备溶液,按色谱条件进行测定,计算加样回收率,结果混合对照品平均回收率分别为100.91%,99.61%,101.72%,100.33%,100.86%,98.74%,RSD分别为0.99%、1.77%、1.56%、1.10%、1.27%、1.67%,表明回收率良好。

2.2 指纹图谱的建立及相似度评价取15批葡萄醋样品,按“2.1.1”项下的色谱条件分别进行测定,记录峰面积并计算各共有峰的保留时间和峰面积。将测出的15个图谱数据全部导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012A版)[12-13],以R色谱图作为参照图谱,经多点校正后,生成葡萄醋的色谱叠加图和对照指纹图谱,并进行相似度评价。15批葡萄醋样品的指纹图谱[14-16]共有峰有11个,通过与混合对照品色谱峰进行比对,指认出6个共有峰[17-18],分别是酒石酸(1号峰),苹果酸(2号峰),琥珀酸(3号峰),富马酸(4号峰),绿原酸(9号峰),乙酸(11号峰)。研究发现葡萄醋中琥珀酸的含量较高,出峰时间相对适中,且峰型稳定,差异较小,分离度较好,故将琥珀酸作为对照峰,计算共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为1.31%～2.00% (n=15)和 83.78%～225.71%(n=15),15批葡萄醋样品中各成分之间含量差异较大。相似度评价[19]结果表明新疆新绿宝药业、新疆麦迪森药业等饮片生产企业出售的葡萄醋相似度均大于0.900,其余自制葡萄醋样品的相似度均小于0.900,且不同批次葡萄醋样品之间相似度相差较大,表明不同地方生产的不同批次葡萄醋中化合物含量存在差异。叠加指纹图谱见图2,对照指纹图谱见图3。

注: 横坐标, 出峰时间; 纵坐标, 峰面积。

图3 样品的 HPLC对照指纹图谱

2.3 基于化学模式识别对葡萄醋的分析

2.3.1 聚类分析 以15批葡萄醋样品的共有峰峰面积为变量,用SPSS 26.0统计软件,以组间平方欧氏距离为测度进行聚类分析[20-21]:当类间距离为25时,15批葡萄醋样品可聚为2类,S1-S5、S7-S12、S14、S15聚为Ⅰ类,Ⅰ类又可聚为2类,S2、S8和S11聚为Ⅰa类,S1、S3-S5、S7、S9、S10、S12、S14、S15聚为Ⅰb类;S6、S13聚为Ⅱ类,结果表明15批葡萄醋样品中各个化合物之间含量差异较大,即使是同一饮片生产企业生产的不同批次葡萄醋其含量差异也较大,与相似度评价结果一致。见图4。

图4 15批葡萄醋样品聚类分析树状图

2.3.2 主成分分析 将15批葡萄醋样品中11个共有峰对峰面积作折线图,结果显示葡萄醋样品共有峰的峰面积数据拟合度较小,样本组间差异较大,故采用无监督的主成分分析方法[22-25],使用的分析软件为 SPSS 26.0。见图5。

图5 15批葡萄醋样品峰面积折线图

利用 SPSS 26.0 软件,对15 批葡萄醋样品指纹图谱中 11 个共有峰峰面积进行标准化处理,再通过主成分分析法进行因子分析,以特征值>1 为提取标准,总方差结果显示,共提取到4个主成分,前4种主成分的累积方差贡献率为90.968% ,表明这4种主成分能较好地揭示葡萄醋来源与11种共有成分的相关性,反映出葡萄醋指纹图谱中共有峰的大部分信息,见表2。

表2 葡萄醋样品的主成分结果

由主成分矩阵可知,第1主成分中,峰 2(苹果酸)、3(琥珀酸)、5、6、9(绿原酸)有较大载荷值;第2主成分中,峰8、10、11(乙酸)有较大载荷值;第3主成分中,峰 4(富马酸)有较大载荷值。峰的载荷值与峰对主成分的贡献成正比,结果显示葡萄醋共有峰含量差异的主要成分并非单一成分,而是前4种主成分共同的影响。见表3。

表3 15 批葡萄醋样品主成分矩阵

结合碎石图可知,当折线由陡峭突然变得平稳时,陡峭到平稳对应的因子个数即为参考提取因子个数,从第4个主成分开始,主成分的特征分值开始缓慢地下降,且前4种主成分的累积方差贡献率达到 90%以上,因此,再次证明葡萄醋共有峰含量差异的主要成分并非单一成分,而是前4种主成分共同的影响。见图6。

图6 15批葡萄醋样品PCA碎石图

2.3.3 偏最小二乘判别分析(PLS-DA) 运用SIMCA14. 0 统计学软件,以11个共有峰的峰面积为变量,绘制 PLS-DA 得分图[26-28],可以看出,S13、S7分布于得分图的左上侧,S3、S9、S11分布于得分图的左下侧,S4、S10、S14、S15分布于得分图的右上侧,S1、S2、S5、S6、S8、S12分布于得分图的右下侧,表明15批葡萄醋样品中共有峰化合物之间含量存在差异。见图7。

图7 15 批葡萄醋样品PLS-DA得分图

根据变量权重要性排序(VIP)可知,7号峰的VIP 值为1.422 68、3号峰(琥珀酸)的VIP 值为1.348 91、9号峰的VIP值为1.120 09 、4号峰(富马酸)的VIP值为1.042 15,表明筛选出的7、3、9、4号峰可作为鉴别和区分葡萄醋质量差异的标志物,其中包括共有峰3号峰(琥珀酸)、4号峰(富马酸),因琥珀酸较稳定,故将琥珀酸作为葡萄醋的特征鉴别成分,并对琥珀酸进行含量测定。见图8。

图8 PLS-DA模型中共有峰的VIP值

3 葡萄醋样品中琥珀酸含量测定

3.1 色谱条件同“2.1.1”色谱条件。

3.2 供试品溶液的制备精密量取10 mL葡萄醋和0.25 mL流动相置于分液漏斗中,摇匀,静置5 min,再精密量取15 mL乙酸乙酯加入分液漏斗中,摇匀萃取,静置分层,反复5次,收集上层滤液约75 mL,将滤液旋转蒸发置干,再于蒸干的圆底烧瓶中加入10 mL已经滤过的超纯水,静置10 min,通过0.22 μm的微孔滤膜,即得到供试品溶液。

3.3 对照品溶液的制备精密称取琥珀酸对照品10.05 mg,加入超纯水配置成每1 mL含1 mg对照品的溶液。

3.4 线性关系考察精密称量0.016 g琥珀酸于10 mL量瓶中,超纯水溶解,定容至刻度线,作为储备液。精密提取琥珀酸储备液0.062 5、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mL,超纯水定容至刻度线,测定峰面积。以琥珀酸进样量(X)为横坐标。以峰面积积分值(Y)为纵坐标,绘制标准曲线得到琥珀酸标品的回归方程Y=560 965X+7 334.8,R2=0.999 7;结果表明琥珀酸浓度在0.05～1.6 mg/mL,呈良好的线性关系[29-30]。

3.5 精密度试验按“3.2”项下方法,制备葡萄醋供试品溶液,按色谱条件重复进样6次,计算琥珀酸峰面积的RSD为1.82%,表明仪器精密度良好。

3.6 重复性试验按“3.2”项下方法,制备葡萄醋供试品溶液6份,按色谱条件进样,计算琥珀酸峰面积的RSD为1.88%,表明本方法重复性良好。

3.7 稳定性试验按“3.2”项下方法,制备葡萄醋供试品溶液,分别在0、6、12、18、24、48 h进样,按色谱条件进样,计算琥珀酸峰面积的RSD值为2.27%,说明样品溶液在48 h内保持稳定[31]。

3.8 回收率试验按“3.2”项下方法,制备葡萄醋供试品溶液6份,每份10 mL,加入琥珀酸0.35 mg,按色谱条件测定,计算加样回收率[32]得到RSD值为1.14%,见表4。

表4 琥珀酸加样回收率结果

3.9 含量测定取15批葡萄醋样品按“3.2”项下方法制备葡萄醋供试品溶液,按色谱条件进样,测得不同批次样品的峰面积,计算含量,见表5。

表5 15批葡萄醋样品中琥珀酸含量

4 讨论

4.1 色谱条件的考察葡萄生长环境、品种、采收时间及酿制时间影响着葡萄醋的质量。据查阅大量参考文献[33-35]发现,葡萄醋主要含有多种有机酸,有机酸不仅影响着葡萄醋的感官特性和稳定性,还决定着葡萄醋的酸味质量,所以是葡萄醋中一类重要的有机化合物。

通过前期研究对流动相(乙腈-水、乙腈-磷酸溶液、甲醇-0.5%磷酸溶液、甲醇-磷酸氢二钠缓冲溶液),柱温(20℃、25℃、30℃),供试品前处理的提取溶剂考察(甲醇、50%甲醇、石油醚(60～90℃),流速(0.8、1.0、1.2 mL/min ),以琥珀酸的峰面积、分离度、峰性状为衡量标准,筛选最优条件,最终确定流动相为甲醇(A)∶0.5%磷酸水溶液(D)=1∶99,检测波长为210 nm,柱温为25℃,流速为1.0 mL/min 。

4.2 建立葡萄醋中有机酸成分的HPLC特征图谱前期预试验发现葡萄醋成品中以有机酸为主,故采用高效液相法,以有机酸含量为主要测定指标,建立了15批葡萄醋中有机酸含量成分的HPLC指纹图谱,标定了11个共有峰;通过与对照品溶液峰面积进行比对,确认了6个共有峰,分别是酒石酸(1号峰),苹果酸(2号峰),琥珀酸(3号峰),富马酸(4号峰),绿原酸(9号峰),乙酸(11号峰),以琥珀酸为对照峰计算共有峰相对保留时间和相对峰面积,通过计算相似度表明不同地方生产的葡萄醋中共有峰成分含量存在一定差异。

4.3 葡萄醋含量差异分析通过聚类分析将不同产地的15批葡萄醋可以聚为2大类,与主成分分析结果一致,主成分分析表明结果显示造成葡萄醋共有峰含量差异的主要成分并非单一成分,而是前4种成分共同影响的,且15批葡萄醋中共有化合物含量差异大。葡萄醋在全疆作为维吾尔药、炮制辅料和发酵食品均在使用,但是没有明确的质量标准和炮制工艺,其发酵机制中参数没有统一标准。

因此,通过建立葡萄醋中有机酸成分指纹图谱,并结合化学模式识别筛选葡萄醋质量差异的标志物,对不同产地葡萄醋的质量进行评价,为临床应用提供参考,同时为制定葡萄醋合理质量控制方法提供研究数据,为后续进一步研究其葡萄醋炮制发酵机制奠定基础。