通过式固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定动物源性食品中30 种食源性兴奋剂

刘 川，李佳佳，吴雪莹，陈燕秋，石培育，宋 娟,，戴 琴,

（1.成都市食品检验研究院，四川 成都 611130；2.国家市场监管重点实验室（营养与健康化学计量及应用），北京 100029）

为加快动物生长速率、提高肌肉比例、降低疾病发生率、保证运输顺应性等，在动物饲养、运输、屠宰等环节可能存在人为添加或残留蛋白同化剂、糖皮质激素和利尿剂等类型食源性兴奋剂的现象[1-3]。消费者长期食用含有该类物质的动物源性食品可能会导致内分泌紊乱、身体抵抗力下降甚至引发癌症[4]。运动员等特殊群体在食用含有该类物质的动物源性食品后会暴露食源性兴奋剂风险，进而影响体育成绩和比赛公平[5-6]，以我国为例，体反兴奋剂字〔2021〕584号中对60 种食源性兴奋剂的限量要求、检测方法均提出了严格要求[7]。目前，我国针对食源性兴奋剂的检测标准主要有农业部1031号公告—2—2008《动物源性食品中糖皮质激素类药物多残留检测 液相色谱-串联质谱法》、农业部1031号公告—1—2008《动物源性食品中11 种激素残留检测 液相色谱-串联质谱法》和SN/T 5167—2019《出口动物源食品中氢氯噻嗪等10 种利尿剂残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法》等国家检测标准。584号文中规定的60 种食源性兴奋剂分散在以上检测标准中，且适用的基质也较少，在实际检测过程中可能导致检测周期过长、需要大量检测人员、不能完全覆盖实际工作的检测等问题，难以满足大型体育赛事用食品检测的时效性要求。

现已有部分针对多种食源性兴奋剂的检测研究，如Shi Yanjing等[3]使用QuEChERS（quick,easy,cheap,effective,rugged,safe）净化结合高分辨质谱同时测定牛奶和乳制品中的48 种兴奋剂残留；冯月超等[8]使用QuEChERS净化，部分同位素内标法定量检测44 种食源性兴奋剂和6 种孕激素；张海超等[9]使用QuEChERS净化，基质曲线测量46 种食源性兴奋剂。以上检测标准和检测方法多使用基质曲线或少量内标进行测定，在测定复杂基质样品时存在基质效应差异较大、难以获得同类型空白基质样品，且睾酮、氢化可的松等兴奋剂属于内源性兴奋剂，针对该类物质的检测过程恐难以制得基质曲线等问题，以上情况导致该类方法在实际使用过程中存在检测效率较低、结果不准确等不足。本研究在对动物源性食品中30 种食源性兴奋剂的检测过程中，对提取和净化流程进行优化，并使用同位素内标进行定量，建立普适性强、灵敏度高、检验结果准确可靠的检测方法，实现同时对10 种蛋白同化剂（美雄酮、司坦唑醇、甲基睾酮、勃地龙、睾酮、丙酸睾酮、诺龙、丙酸诺龙、苯丙酸诺龙、群勃龙），8 种糖皮质激素（泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、地塞米松、倍他米松、倍氯米松、氟氢可的松、氢化可的松）和12 种利尿剂（氢氯噻嗪、乙酰唑胺、氯噻嗪、氯噻酮、呋塞米、苄氟噻嗪、氨苯蝶啶、螺内酯、坎利酮、精磺胺、托拉塞米、布美他尼）的检测分析，旨在为保障大型体育赛事的运行提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、地塞米松、倍他米松、倍氯米松、氟氢可的松、氢化可的松、美雄酮、司坦唑醇、甲基睾酮、勃地酮、睾酮、丙酸睾酮、诺龙、丙酸诺龙、苯丙酸诺龙、群勃龙、氢氯噻嗪、乙酰唑胺、氯噻嗪、氯噻酮、呋塞米、苄氟噻嗪、氨苯蝶啶、螺内酯、坎利酮、精磺胺、托拉塞米、布美他尼，美雄酮-D3、司坦唑醇-D3、甲基睾酮-D3、勃地酮-D3、睾酮-D3、丙酸睾酮-D3、诺龙-D3、丙酸诺龙-D3、群勃龙-D3、氨苯蝶啶-D5、坎利酮-D6、托拉塞米-D7、布美他尼-D5、泼尼松-D8、泼尼松龙-D6、甲基泼尼松龙-D3、地塞米松-D5、倍他米松-D5、倍氯米松-D5、氟氢可的松-D5、氢化可的松-D3、氢氯噻嗪-D2、乙酰唑胺-D3、氯噻嗪-13C,15N2、氯噻酮-D4、呋塞米-D5、卞氟噻嗪-D5、精磺胺-15N2均为100～1000 μg/mL的标准品溶液 天津阿尔塔科技有限公司。

甲酸、甲醇、乙腈（色谱纯）德国Merck公司；氯化钠、正己烷（分析纯）重庆川东化工（集团）有限公司；PRiME HLB固相萃取小柱（500 mg/6 mL）美国Waters公司；陶瓷均质子（50 mL离心管用）上海安谱实验科技股份有限公司；实验用水符合GB/T 6682—2008《分析实验室用水规格和实验方法》实验室一级用水。

猪肉、鸡肉、虾、鸡蛋、牛奶以及部分相关制品共50余批次样品均购自于市场。

1.2 仪器与设备

ExionLC-Triple Quad™ 6500＋超高效液相色谱-串联质谱仪 美国AB SCIEX公司；Centrifuge 5810 R高速离心机 德国Eppendorf公司；Milli-Q超纯水仪 美国Millipore公司；BP211D型天平 德国Sartorius公司；ME203型天平 瑞士Mettler Toledo公司；Atlantis C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）、ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）、ACQUITY UPLC HSS C18色谱柱（3.0 mm×150 mm，1.7 μm）美国Waters公司；ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 标准物质的配制

1.3.1.1 混合标准中间溶液配制

分别准确吸取不同体积的泼尼松、泼尼松龙等标准品溶液于同一棕色容量瓶中，用甲醇溶液定容至刻度，摇匀得混合标准中间溶液（美雄酮、司坦唑醇、甲基睾酮、丙酸睾酮、诺龙、丙酸诺龙、苯丙酸诺龙、勃地酮、群勃龙、睾酮质量浓度为100 ng/mL，泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、地塞米松、倍他米松、倍氯米松质量浓度为125 ng/mL，氟氢可的松、精磺胺质量浓度为250 ng/mL，氢化可的松、氯噻嗪、氢氯噻嗪质量浓度为500 ng/mL，氯噻酮、氨苯蝶啶、乙酰唑胺、螺内酯、呋塞米、坎利酮、苄氟噻嗪、托拉塞米、布美他尼质量浓度为1250 ng/mL）。

1.3.1.2 同位素内标标准溶液配制

分别准确吸取不同体积的美雄酮-D3、司坦唑醇-D3等标准品溶液至同一棕色容量瓶中，用甲醇溶液定容至刻度，摇匀得同位素内标标准溶液（美雄酮-D3、司坦唑醇-D3、甲基睾丸酮-D3、丙酸睾酮-D3、诺龙-D3、丙酸诺龙-D3、勃地酮-D3、群勃龙-D3、睾酮-D3、泼尼松-D8、泼尼松龙-D8、甲基泼尼松龙-D2、地塞米松-D4、倍他米松-D5、倍氯米松-D5质量浓度为100 ng/mL，氟氢可的松-D、氢化可的松-D3、精磺胺-15N2、氯噻嗪-13C,15N2、氢氯噻嗪-D2、氯噻酮-D4、氨苯蝶啶-D5、乙酰唑胺-D3、呋塞米-D5、坎利酮-D6、苄氟噻嗪-D5、托拉塞米-D7、布美他尼-D5质量浓度为1000 ng/mL）。

1.3.1.3 标准曲线工作溶液配制

分别吸取10、20、50、100、200、400 μL混合标准中间溶液和50 μL同位素内标标准溶液于不同1 mL容量瓶中，用30%甲醇溶液（含4%甲酸）定容至刻度，摇匀，得到标准曲线工作溶液。

1.3.2 样品前处理

1.3.2.1 提取

准确称取均质样品5 g（精确至0.01 g），置于50 mL离心管中并加入100 μL同位素内标标准溶液，加入均质子和5 mL水，涡旋混匀5 min。加入20 mL 5%甲酸-乙腈，涡旋混匀15 min，超声30 min，再加入8 g氯化钠，涡旋混匀5 min，于4 ℃、9500 r/min条件下冷冻离心5 min，取上清液于另一离心管中，加入10 mL乙腈饱和正己烷溶液，涡旋混匀5 min，于4 ℃、9500 r/min条件下离心5 min，弃去正己烷层，下层溶液待净化。

1.3.2.2 净化

取10 mL下层溶液过PRiME HLB小柱，加入2 mL 5%甲酸-乙腈进行洗脱，收集滤液于氮吹管中，45 ℃氮吹至近干，加入1.0 mL 30%甲醇溶液（含4%甲酸）溶解残渣，涡旋混合1 min，超声2 min，过0.22 μm滤膜，滤液于超高效液相色谱-串联质谱仪测定。

1.3.2.3 条件优化

本研究选择乙腈作为基础提取溶剂，考察乙腈、0.1%甲酸-乙腈、0.5%甲酸-乙腈、1%甲酸-乙腈、2%甲酸-乙腈、5%甲酸-乙腈和6%甲酸-乙腈对不同基质中30 种食源性兴奋剂的提取效率。同时对PRiME HLB（200 mg/6 mL）、PRiME HLB（500 mg/6 mL）、EMR（300 mg/3 mL）、EMR（500 mg/6 mL）、lipono和Nano QuEChERS净化管与未经净化的提取液对目标物净化效果进行考察。

1.3.3 液相色谱-串联质谱条件

1.3.3.1 液相色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC HSS C18（3.0 mm×150 mm，1.7 μm）；流动相：A为5 mmol/L甲酸铵溶液（含0.1%甲酸），B为0.1%甲酸-甲醇溶液；流速：0.4 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：5 μL；梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution procedures

1.3.3.2 质谱条件

离子源类型：电喷雾电离源；气帘气（氮气）压力：35 psi；喷雾气（氮气）压力：55 psi；辅助加热气（氮气）压力：55 psi；离子源温度：400 ℃；离子化电压：5000 V/－4500 V；扫描模式：多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式。监测离子对和质谱参数见表2。

表2 30 种食源性兴奋剂的质谱条件与保留时间Table 2 Mass spectrometric parameters and retention time of 30 foodborne stimulants

1.3.3.3 色谱条件优化

选择超高效液相色谱柱为研究对象，以提高色谱分离效果并节约流动相。考察了Atlantis C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）、ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、ACQUITY UPLC BEH C18（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）、ACQUITY UPLC HSS C18（3.0 mm×150 mm，1.7 μm）4 种色谱柱对待测化合物的分离效果。

以甲醇和乙腈为有机相，以0.1%甲酸溶液、0.5%甲酸溶液、5 mmol/L甲酸铵溶液、10 mmol/L甲酸铵溶液、5 mmol/L甲酸铵（0.1%甲酸）溶液、10 mmol/L甲酸铵（0.1%甲酸）溶液和20 mmol/L甲酸铵（0.1%甲酸）溶液为流动相水相，分别考察不同有机相和流动相对各目标物的分离效果和响应差异。

1.3.3.4 质谱条件优化

在流动注射方式下分别对30 种食源性兴奋剂以及同位素内标进行质谱参数优化，根据对比各目标物母离子响应强度选择各自适宜的正负离子扫描模式，并确定各目标物的m/z。以此为基础选取该母离子响应相对较高、专属性较强的2 个子离子建立MRM通道，并对去簇电压和碰撞电压优化，同时在接入流动相后继续优化气帘气、喷雾气、辅助加热气、离子源温度、离子化电压等条件。

1.3.4 基质效应考察

分别称取不同品种且适量份数的空白基质样品，除不加入同位素内标标准溶液外均按照1.3.2节获取空白样品提取液。分别使用空白样品提取液和30%甲醇溶液（含4%甲酸）稀释成标准曲线工作液，以基质标准曲线斜率与溶剂标准曲线斜率的比值考察30 种兴奋剂的基质效应。

2 结果与分析

2.1 提取条件优化

乙腈具有沉淀蛋白、与油脂相容性较差等特性，是提取动物源性食品中有关物质最为常见的提取溶剂[10]，本研究按照1.3.2.3节所述分别考察了乙腈和不同比例甲酸-乙腈的提取效率，结果表明，不同含酸量的乙腈其提取效率表现出较大差异（图1）。以猪肉为例，不同酸度的甲酸-乙腈对糖皮质激素和大部分利尿剂提取效率差异并不明显，但对于司坦唑醇、丙酸睾酮、诺龙、丙酸诺龙、苯丙酸诺龙、氯噻酮、布美他尼、苄氟噻嗪等极性较小的食源性兴奋剂，提取效率与甲酸-乙腈的酸度呈正相关，且表现出较大差异，5%甲酸-乙腈和6%甲酸-乙腈对以上几种物质的提取效率差异不大。为兼顾30 种兴奋剂的提取效率，本研究选择5%的甲酸-乙腈作为提取溶剂。

图1 6 种提取溶剂的提取效率对比Fig.1 Comparison of extraction efficiencies of six solvents

2.2 净化方式考察

由于动物源性食品中含有大量脂溶性杂质、色素等干扰物，容易干扰仪器检测，因此，对净化方法进行优化。目前主流的净化方式有固相萃取、QuEChERS、液液分散萃取等。而通过式固相萃取小柱净化具有免活化、操作简单等优点[11-12]，本研究按照1.3.2.3节所述对不同净化方式的净化效果进行考察，结果见表3。PRiME HLB小柱（500 mg/6 mL）净化后回收率较高，对去除基质效应的效果更好，因此选择PRiME HLB小柱（500 mg/6 mL）为净化所用。

表3 不同净化方式的回收率Table 3 Comparison of recoveries of different purification methods

2.3 色谱条件优化

2.3.1 色谱柱选择

4 种色谱柱在同一流动相条件下对待测物的色谱保留性能相似，其中ACQUITY UPLC HSS C18（3.0 mm×150 mm，1.7 μm）色谱柱对30 种物质的分离效果、峰型和对称度更好。

2.3.2 流动相选择

对流动相的有机相考察研究结果表明，由于螺内酯和坎利酮为同分异构体，选择乙腈作为有机相时，化合物不能完全分离；选择甲醇作为流动相的有机相时，化合物均可分离且分离度较好。同时比较了甲醇、0.1%甲酸-甲醇和0.5%甲酸-甲醇对30 种食源性兴奋剂信号响应的差异，有机相为含酸甲醇时大部分化合物响应均高于甲醇，结合色谱条件的普适性，选择0.1%甲酸-甲醇作为流动相的有机相[13-14]。

同时在流动相水相考察研究中发现，群勃龙、甲基睾酮、美雄酮、诺龙、丙酸诺龙、苯丙酸诺龙等蛋白同化剂在甲酸铵溶液作为流动相水相时的响应情况明显高于甲酸溶液，继续在甲酸铵溶液中加入甲酸，布美他尼、精磺胺等利尿剂响应得到提升。结合目标物响应与峰形等因素，选择5 mmol/L甲酸铵（0.1%甲酸）溶液作为流动相的水相[14]。

30 种兴奋剂在使用0.1%甲酸-甲醇和5 mmol/L甲酸铵（0.1%甲酸）溶液作为流动相时的色谱图见图2，地塞米松和倍他米松在该色谱条件下无法分离，在检出时，可通过调整色谱条件后进行单独测定。

图2 30 种食源性兴奋剂标准溶液提取离子色谱图Fig.2 Extracted ion chromatograms of 30 foodborne stimulant standard solutions

2.4 质谱条件优化

各目标物母离子、子离子等相关参数见表2。质谱条件优化结果表明，蛋白同化剂在正离子扫描模式下响应更高[15-16]，氨苯喋啶、螺内酯、坎利酮、托拉塞米、布美他尼在正离子模式下响应高于负离子模式；正离子模式下以上物质母离子均呈现[M＋H]＋离子峰。而糖皮质激素和其余利尿剂在负离子模式下响应更高[8-9,17-19]，其母离子为[M－H]－离子峰。各目标物的定量子离子和定性子离子均在权衡灵敏度和专属性等方面后进行选择。

2.5 复溶溶剂优化

在保证其他条件不变的情况下，对不同比例的甲醇溶液进行考察。结果表明，当有机相比例大于30%时，氨苯蝶啶峰形较差，具有较为明显的溶剂效应。在保证有机相比例不变的情况下，考察含有不同比例甲酸的复溶效果，由于丙酸睾酮、诺龙、丙酸诺龙、苯丙酸诺龙等化合物的脂溶性较强，其回收率与复溶溶剂中甲酸酸度呈正相关[20]。但当甲酸含量大于4%时，该类化合物的回收率基本不变，因此，选择30%甲醇溶液（含4%甲酸）作为复溶溶剂。

2.6 基质效应的优化

使用液相色谱-串联质谱法检测动物源性食品过程中可能带入不同程度的基质效应，基质效应的存在直接影响检测结果的准确性[21-22]，因此，本研究按照1.3.4节所述对基质效应进行评估。若基质标准曲线斜率与溶剂标准曲线斜率的比值在0.85～1.15之间，则认为不存在基质效应，反之则存在基质效应。30 种目标物的基质效应结果见表4。结果表明，检测不同基质中的食源性兴奋剂时均存在较明显的基质效应，且由于部分预制型动物源性食品的基质更为复杂，本研究为减少基质效应对实际样品测定的干扰，采用同位素内标法做定量分析[13]。

2.7 线性关系、检出限与定量限优化

对1.3.1.3节所配制的标准曲线工作溶液进行测试，并建立不同物质的标准曲线，不同物质的线性范围和对应同位素内标见表4。采取在空白试样中逐级稀释加标浓度的方式确定30 种食源性兴奋剂的检出限和定量限[23]。同时在不同基质中加入检出限和定量限水平的标准物质，按照1.3.2.1节和1.3.2.2节的方法进行检测。结果表明，不同基质中检出限水平的各食源性兴奋剂其定性离子对、定量离子对信噪比均大于3；定量限水平的各食源性兴奋剂其定性离子对、定量离子对信噪比均大于10[24]。

2.8 方法回收率与精密度

依据GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》，分别称取猪肉、鸡肉、虾、牛奶、鸡蛋空白基质样品，按照定量限、两倍定量限和10 倍定量限进行3水平添加实验（n＝6），按照1.3.2.1节和1.3.2.2节方法对样品进行处理和检测，考察所确定方法的回收率和精密度[25]。如表5所示，本研究的平均回收率在67.5%～114.3%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为0.7%～16.1%。

2.9 实际样品测试

采用本方法对购于市场的猪肉、鸡肉、虾、鸡蛋、牛奶以及部分相关制品共50余批次样品进行30 种食源性兴奋剂的检测，在1 批次猪肉制品中检出4.52 μg/kg的氢化可的松，采用农业部1031号公告—2—2008进行技术验证，氢化可的松的测定结果为4.28 μg/kg，两种方法测得结果的RSD为5.20%。另有1 批次牛肉中检出1.78 μg/kg的睾酮，采用农业部1031号公告—1—2008对以上样品进行技术验证，睾酮的测定结果为1.68 μg/kg，两种方法测定结果的RSD为5.88%。综上，本方法在有效缩减提取净化步骤、节省检验时间、增加检测通路、提高检验效率的同时依然能够保证数据的准确度。

3 结论

本研究针对动物源性食品中30 种食源性兴奋剂的检测需求，通过优化仪器条件、提取溶剂、净化方式和定量方法等建立了通过式固相萃取-液相色谱-串联质谱的检测方法。该方法能有效消除不同复杂基质样品检测过程中的基质效应，具有灵敏度高、检测通量较大、操作简单、普适性高等优点，能够满足赛事用动物源性食品中10 种蛋白同化剂、8 种糖皮质激素和12 种利尿剂的检测需求。