消渴健脾胶囊对脾虚湿盛型2型糖尿病大鼠生化指标及病理组织学的影响※

马美玲,杨明霞,丁然然

(1.新疆医科大学,新疆 乌鲁木齐 830000;2.新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市中医医院,新疆 乌鲁木齐 830000)

糖尿病是常见的内分泌代谢疾病,以体内胰岛素缺乏或抵抗引起的葡萄糖水平升高、蛋白质与脂质代谢紊乱为主要特征[1]。根据世界卫生组织(WHO)的数据,预测到2030年,全球糖尿病人数约为5.78亿人,到2045年,全球患糖尿病人数约为7亿人,其中2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)占90%以上[2]。T2DM常伴有肝、脾、肺等多器官损伤,严重危害患者的身心健康,带来沉重的经济负担[3]。消渴健脾胶囊是乌鲁木齐市中医医院创制的院内制剂,该药物由苍术、茵陈、葛根、白术等多味药物组成,具有健脾燥湿、行气和胃、祛浊化郁的功效,在治疗脾失健运、湿阻中焦、腑气不通所致的口干口苦、乏力汗多、大便干燥、肥胖、糖脂代谢紊乱等方面疗效较好[4]。本研究主要研究消渴健脾胶囊对脾虚湿盛型2型糖尿病大鼠生化指标及病理组织学的影响,进一步明确消渴健脾胶囊治疗脾虚湿盛型2型糖尿病的作用机制,为该药的开发利用提供实验依据。

1 材料

1.1 动物 选取SPF级雄性SD大鼠50只,6～8周龄,体质量(200±20)g,购自新疆医科大学动物实验中心,生产许可证SYXK(新)2018-0001。基础饲料由新疆医科大学动物实验中心提供;高脂高糖饲料购于北京爱博港生物有限公司,成分重量百分比组成为基础饲料67.7%、蔗糖20%、猪油10%、胆固醇2.0%、胆酸盐0.3%。

1.2 药物 消渴健脾胶囊药物组成:苍术15 g,白术15 g,大黄10 g,厚朴10 g,茵陈10 g,茯苓10 g,栀子6 g,土茯苓6 g,车前子6 g,莱菔子6 g,丹参6 g,木瓜6 g。由乌鲁木齐市中医医院药剂科提供,使用时用0.9%氯化钠注射液配制成含药量1 g/mL的药液。

1.3 主要试剂 链脲佐菌素(批号010-83004443),购自美国Sigma公司;柠檬酸钠(批号CA8号6132-04-3),购自成都市科龙化工试剂厂;柠檬酸(批号20200107),购自上海青浦群力化工厂;0.9%氯化钠注射液(批号19022701),购自新疆华世丹药业股份有限公司;无水乙醇(批号XK20-0123-006)、二甲苯(批号XK13-001-00031),购自天津市致远化学试剂有限责任公司;伊红染液(批号ML5641)、苏木素染液(批号C210903),购自珠海贝索生物技术有限公司。

1.4 主要器材 迈瑞 BS-240VET全自动生化仪;拜安进血糖仪、血糖试纸(安晟信糖尿病保健股份公司);无菌注射器(国安医械科技有限公司);多管架离心机(新疆医科大学);自动真空组织脱水机、石蜡切片机、包埋机(德国徕卡,RM2245)。

2 方法

2.1 造模 将50只SD大鼠适应性饲养1周,采用随机数字法取10只作为空白组,其余40只大鼠给予高脂饲料饲养8周,腹腔注射STZ(35 mg/kg)溶液2次,注射间隔7 d。T2DM大鼠造模成功标准为随机血糖≥16.7 mmol/L。将T2DM大鼠采用过劳+饮食不节+湿热环境法进行脾虚湿盛型造模:大鼠每天在水迷宫游泳30 min,单日喂食高脂饲料,双日喂食大白菜(大白菜喂食量不限,自由进水),3周后将大鼠放入人工气候舱1周[温度(32±0.5)℃、湿度(65±0.5)%],大鼠出现倦怠扎堆取暖、懒动、毛色晦暗、粪便稀溏或带黏液表明造模成功。

2.2 分组及给药 将造模成功的脾虚湿盛型T2DM大鼠随机分为模型组和消渴健脾胶囊低、中、高剂量组,每组10只。空白组、模型组给予0.9%氯化钠注射液5 mL/kg灌胃;消渴健脾胶囊低、中、高剂量组分别给予消渴健脾胶囊溶液50、100、200 mg/kg浓度灌胃。给药剂量参考《药理实验方法学》[5]。每日灌胃1次,连续4周,平时给予基础饲料喂养。

2.3 标本收集 末次给药24 h后,剪取大鼠尾部静脉血检测空腹血糖(FBG)。采用1%戊巴比妥溶液(30 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,解剖后于腹主动脉取血,4 ℃冰箱保存。采血后摘取大鼠胰腺、脾脏、心脏、肺脏,用0.9%氯化钠注射液冲洗后,保存至4%多聚甲醛中固定24 h。

2.4 生理指标 各组大鼠在造模前、造模后、干预治疗后测定体质量。

2.5 生化指标 FBG:大鼠禁食12 h断尾采血,用血糖仪测定血糖。糖化血清蛋白(GSP):大鼠禁食12 h,腹主动脉采血5 mL,用离心机27 ℃恒温离心15 min(2 500 r/min,离心半径=10 cm),取血清,采用酶联免疫吸附法测定(ELISA)。

2.6 标本制备 将经4%多聚甲醛固定液浸泡固定的大鼠组织标本切成2 mm×3 mm×4 mm大小的组织块。①脱水:将大鼠组织固定于4%多聚甲醛24 h以上,取出后用洁净的水冲洗4 h,然后进行梯度洗脱,顺序为70%(1 h)、80%(1 h)、90%(1 h)、95%(1 h)、100% Ⅰ(0.5 h)、100% Ⅱ(0.5 h)。②将洗脱后的组织放入石蜡内,置于包埋机上冷却,用铅笔做好标记。③样本完全冷却后,切成5 μm的薄片,放于45 ℃水浴锅中展开,转移到载玻片上,在60 ℃温箱中烘干2 h。④依次将切片放入二甲苯Ⅰ 20 min、二甲苯Ⅱ 20 min、无水乙醇15 min、无水乙醇25 min、75%酒精5 min,自来水冲洗10 min。切片烘干。⑤苏木素浸染3 min,蒸馏水洗后,用1%盐酸酒精分化数秒。水洗30 s后烘干。⑥伊红液染色6 s、水洗3 s 后,切片依次放入95%酒精Ⅰ 5 min、95%酒精Ⅱ 5 min、无水乙醇Ⅰ 5 min、无水乙醇Ⅱ 5 min、二甲苯Ⅰ 5 min、二甲苯Ⅱ 5 min中脱水透明,拿出烘干。⑦烘干后用中性树胶封片,光学显微镜镜检,观察采集图像并分析结果。

3 结果

3.1 消渴健脾胶囊对各组大鼠体质量的影响 与空白组比较,其余各组大鼠造模后体质量均明显下降(P<0.05)。干预后,与模型组比较,消渴健脾胶囊低、中、高剂量组体质量均有增加,其中高、中剂量组增加明显(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠造模前、造模后、药物干预后体质量比较

3.2 消渴健脾胶囊对各组大鼠FBG、GSP水平的影响 给药4周后,与空白组比较,模型组FBG水平升高(P<0.05);低、中、高剂量组FBG水平较模型组明显降低(P<0.05)。与空白组比较,模型组GSP水平明显升高(P<0.05);与模型组比较,消渴健脾胶囊中、高剂量组GSP水平明显降低(P<0.05);低剂量组GSP水平与模型组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠给药4周后空腹血糖、糖化血清蛋白水平比较[M(P25,P75)]

3.3 消渴健脾胶囊对各组大鼠病理组织形态学的影响 如图1(扫描题目右侧二维码查看)所示,空白组大鼠心肌细胞染色均匀,心肌纤维排列整齐,结构纹理清晰,形态结构正常,分界清晰,未见明显炎症。模型组组织中可见较多心肌纤维断裂,空泡变性,呈波浪状排列,胞质中可见较小的圆形空泡,少量心肌纤维水肿,胞质疏松淡染,有炎症细胞浸润。中、高剂量组组织染色均匀,心肌纤维排列整齐,形态结构正常,分界清晰,未见明显炎症。

如图1(扫描题目右侧二维码查看)所示,空白组大鼠脾小体组织结构正常,红髓和白髓比例正常。模型组大鼠脾小体动脉壁增厚,管腔变小,红髓和白髓比例异常,生发中心不明显。中、高剂量组大鼠脾脏在干预后,脾小体被膜皱缩逐渐缓解,红髓和白髓比例正常,结构清晰,可观察到明显的生发中心。

如图1(扫描题目右侧二维码查看)所示,空白组大鼠肺脏组织正常,肺泡内无出血现象,结构完整清晰,肺泡壁薄。模型组大鼠肺泡内有出血现象,肺泡壁厚度增加,肺泡面积减小,肺泡腔可见明显的炎症细胞浸润。低剂量组与模型组无太大差异。中、高剂量组大鼠肺组织结构完整清晰,肺泡无破裂、塌陷现象,无明显淤血,肺泡壁增厚减轻,肺间质内炎症细胞浸润减少。

如图1(扫描题目右侧二维码查看)所示,空白组大鼠胰腺内胰岛结构清晰,数量较多,胰岛细胞排列有序,形态清晰且规则,胞浆丰富,边界分明。模型组胰岛数量减少,细胞排列紊乱,细胞萎缩或塌陷较多,胰岛形态不规则。中、高剂量组胰岛体积均有不同程度的减少,胰岛细胞萎缩现象较模型组减少明显,胰岛细胞排列优于模型组。

4 讨论

T2DM属于中医“消渴”“脾瘅”“消瘅”等范畴。《素问·奇病论》云:“此人必数食甘美而多肥也,肥者令人生热,甘者令人中满,故其气上益,转为消渴。”长期过食肥甘厚味是发生T2DM的重要因素,饮食不节、过食肥甘厚味损伤脾胃,脾虚运化无力是其关键,中焦升降失司,水谷精微不能输布濡养周身,因此产生痰、湿、瘀等病理产物,导致高血糖、高血脂、肥胖、胰岛素抵抗等证[6]。这说明脾脏的功能失司是T2DM发生的重要因素。脾为后天之本,脾虚湿盛是T2DM的主要病机,益气燥湿健脾为T2DM的主要治法。

消渴健脾胶囊具有健脾化湿、消胀泄满、行气止渴、泄热祛烦的功效,用于T2DM及其并发症的临床疗效较好[7-8]。临床研究表明,消渴健脾胶囊能降低T2DM患者血清瘦素、血糖水平,改善胰岛功能,增加胰岛素敏感性[8-9]。本研究结果显示,相较于模型组,消渴健脾胶囊中、高剂量组FBG、GSP水平均明显降低,说明消渴健脾胶囊可降低大鼠血糖。研究发现,苍术具有降低血糖、血尿酸、血压及保护心肌的作用[10];白术中的有效成分可与前蛋白转化酶结合,在T2DM中发挥着重要作用[11];茯苓味甘入脾经,功效补益和中,与白术合用,增强茯苓健脾之效;葛根可减轻胰岛素抵抗的程度,保护胰岛β细胞[12]。本研究结果显示,干预后消渴健脾胶囊中、高剂量组大鼠心肌细胞形态结构正常,排列规则,分界清晰,细胞间质未见明显炎症及异常;脾脏组织结构正常且清晰;肺泡结构完整清晰,无出血,肺间质炎症浸润减少;胰腺组织胰岛结构清晰,体积减小,胰岛细胞萎缩现象较模型组明显减少。

综上所述,消渴健脾胶囊可显著降低脾虚湿盛型T2DM大鼠血糖水平,改善大鼠心脏、脾脏、肺脏、胰腺等组织的病理改变,提示消渴健脾胶囊在治疗脾虚湿盛型T2DM方面具有潜在的应用价值;同时,本研究初步探讨消渴健脾胶囊具有改善大鼠病理组织的作用,为消渴健脾胶囊在脾虚湿盛型T2DM中的应用提供理论基础。