妊娠合并外阴阴道假丝酵母菌病患者的阴道菌群构成＊

张 宁 肖泽兵 张新丽 管晓阳 王艳玲 孙秀丽

濮阳市妇幼保健院产前诊断中心 (河南 濮阳 457000)

外阴阴道假丝酵母菌病(Vulvovaginal candidiasis，VVC)是由机会致病菌假丝酵母菌引起的育龄妇女最常见的一种外阴阴道炎症性疾病[1-2]。同时研究表明，妊娠期妇女的假丝酵母菌感染率高于非孕妇女。妊娠合并VVC不仅会对孕妇的身体和心理带来困扰，还会增加不良妊娠结局的发生几率，严重影响胎婴健康[3-5]。本研究对孕早、中、晚期合并VVC患者的阴道分泌物进行16S rDNA V3V4可变区测序，并与健康孕妇的阴道微生物组成相比较，试图对妊娠合并VVC患者的阴道菌群结构特征进行描述和分析[6]。

1 资料与方法

1.1 一般资料本实验由濮阳市妇幼保健院伦理委员会审核并批准同意开展。研究对象均为我国汉族人，年龄20～40岁，入选病例的孕周划分为早孕组(孕5-12+6周)、中孕组(孕13-27+6周)、晚孕组(孕28周以上)。选取 2022年10月至 2023年3月期间在产科门诊首次确诊为妊娠合并 VVC 患者共 52 例，根据孕周不同，将妊娠合并 VVC 患者分为早孕组(VE)20例、孕中期(VM)9例、孕晚期(VL)23例；因此，编号VE-01表示 VE 组第1个患者的阴道分泌物，以此类推 VE-02、VE-03、……VE-20，VM-01、VM-02、……VM-09，VL-01、VL-02、……VL-23等。健康孕妇共69例，分别为孕早期(CE)30例、孕中期(CM)9例、孕晚期(CL)30例；编号为CE-01、CE-02、……CE-30，CM-01、CM-02、……CM-09，CL-01、CL-02、……CL-30等。

1.2 入组标准

1.2.1 妊娠期VVC患者纳入标准 临床表现为外阴瘙痒、灼痛，白带增多等；外阴潮红、水肿，阴道内见较多白色粘稠凝乳或豆渣样分泌物；pH小于4.5；显微镜观察发现有芽生孢子和假菌丝。排除标准：复发性VVC；细菌性阴道病、细胞溶解性阴道病等；糖尿病、免疫系统性疾病、激素治疗性疾病等。

1.2.2 健康组纳入标准 选取同时期进行孕期检查的健康孕妇，详细询问病史及用药史、阴道分泌物Nugent评分等。入组标准需要同时满足：无临床症状；阴道清洁度分级为Ⅰ～Ⅱ级；Nugent评分 0～3分；1月内未使用抗菌素及阴道局部用药，3d内无性生活史，无糖尿病等。

1.3 方法

1.3.1 标本采集 经研究对象知情同意后，嘱咐孕妇先排尽尿液。观察并记录外阴、阴道壁、宫颈黏膜有无充血、水肿、白色膜状覆盖物等，阴道分泌物的颜色、性状、量及有无异味。用3根无菌棉式子于阴道后穹隆及上1/3采集分泌物，避免碰触其他部位以防标本污染。1根进行常规实验室镜检；2根用于阴道分泌物基因组DNA的提取。

1.3.2 标本基因组DNA的提取 基因组DNA抽提试剂盒选用 The PowerSoil® DNAIsoilation kit(美国 MOBIO)，实验步骤严格按照试剂盒说明书进行。用 Nanodrop 2000 进行各标本基因组DNA的浓度及纯度的测定，浓度≥ 20.0ng/μl， OD260/OD280＝1.8～2.0视为合格标本，于-20 ℃冷冻保存备用。2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并切胶回收以提高纯度。

1.3.3 16S rDNA V3V4区基因扩增及Illumina测序 选择细菌 16SrDNA V3V4 高变异区基因片段进行PCR特异性扩增，采用正向引物F:ACTCCTACGGGAGGCAGCA ，反向引物R:GGACTACHVGGGTWTCTAAT。送上海派森诺生物技术股份有限公司，基于Illumina-NovaSeq-6000 测序平台进行测序分析。切胶回收后的PCR产物利用ABI StepOne(ABI，USA)荧光定量分析平台进行定量检测，计算每个样品的测序量，按照合适的比例均匀混合。上机测序前，样本逐一质检，且浓度在 2nM 以上视为合格。根据Illumina NovaSeq 6000 测序平台要求，将纯化后的PCR扩增片段进行文库构建、测序、分析。

1.4 统计分析测序数据用R软件进行统计学分析；α多样性采用Kruskal-Wallis检验进行菌群丰富度和均匀度的比较分析，Beta多样性使用LEfSe (linear discriminant analysis effect size)[7]分析组间具有显著差异的标志物种；计数资料用(%)表示。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 测序结果本项目采用Illumina平台对群落DNA片段进行双端(Paired-end)测序。共完成121例样品测序，获得去除singleton后的高质量序列10 700 662条Reads，平均每个样品为88 435 条Reads，最少的样本为 49 576 条 Reads。经QIIME2 软件注释，CE组、CM组、CL组、VE组、VM组、VL组分别鉴定出独有的所包含的ASV/OTU的数目为1537个、1036个、5100个、2060个、444个、1778个，其中共有的为112个。见图1。

图1 不同组间 OTUs 的韦恩图。图2 不同分组的稀释曲线图。图3 CE、VE组的Shannon指数分布。图4 CM、VM组的Shannon指数分布。图5 CL、VL组的Shannon指数分布。图6 CE、VE组的LEfSe分析。图7 CM、VM组的LEfSe分析。图8 CL、VL组的LEfSe分析。图9 不同分组的细菌门水平物种组成。图10 不同分组的细菌属水平物种组成。

2.2 Alpha多样性分析 随着测序深度的增加，各分组中的菌群OTU 曲线趋于平稳，表明测序结果已足够反映当前样本所包含的菌群组成多样性。见图2。

Shannon指数结合了丰度和均匀度信息，衡量菌落的异质性。CE组与VE组、CL组与VL组之间的 Shannon指数比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，CM组与VM组之间的 Shannon指数比较，无显著统计学差异。见图3、图4、图5。

2.3 物种差异与标志物种分析/ LEfSe分析 LEfSe法可以筛选微生物群落的标志性物种，直观清晰地展示了样本群落中从门到属(从内圈到外圈)主要分类单元的分类等级关系。图6在仅有CE组和VE组参与分析时，蓝色的差异物种在CE组中上调，红色的差异物种在VE组中上调。图7结果显示这些差异物种是在两组之间产生的，在CM组丰度更高。图8在仅有CL组和VL组参与分析时，蓝色的差异物种在CL组中上调，红色的差异物种在VL组中上调。

2.4 物种注释结果在门水平上，共发现25个门，CE组、VE组、CM组、VM组、CL组、VL组均以厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)占主要比例，见图9。在属水平上，共发现51个属，见图10。乳杆菌属可在全部样本中检出,其次为加德纳氏菌属、普雷沃氏菌属、阿托波菌属等。CE组占比超过0.5%的主要属，依次为乳杆菌属(Lactobacillus) 87.34%, 加德纳菌属(Gardnerella) 4.8%, 阿托波菌属(Atopobium)4.06%, 链球菌属(Streptococcus)1.64%, 双歧杆菌属(Bifidobacterium)0.64%, 普氏菌属(Prevotella)0.52%.CM组依次为乳杆菌属(Lactobacillus)74.03 %，加德纳菌属(Gardnerella) 10.88 %，双歧杆菌属(Bifidobacterium)10.72 %,普氏菌属(Prevotella)1.33 %，小球菌属(Pediococcus)0.51 %.CL组依次为乳杆菌属88.44%，加德纳菌属4.46%，双歧杆菌属1.73%，普氏菌属0.42%，阿托波菌属 0.69%.VE组依次为乳杆菌属(Lactobacillus)60.45 %，加德纳菌属(Gardnerella) 23.76 %，双歧杆菌属(Bifidobacterium)6.64 %,阿托波菌属(Atopobium)4.82 %,普氏菌属(Prevotella)1.32 %，气球菌属(Aerococcus)0.99%.VM组依次为乳杆菌属(Lactobacillus) 88.19 %，加德纳菌属(Gardnerella) 9.44 %，阿托波菌属(Atopobium)0.79 %.VL组依次为乳杆菌属(Lactobacillus) 74.2 %，加德纳菌属(Gardnerella) 18.67 %，阿托波菌属(Atopobium)4.17 %，气球菌属(Aerococcus)0.94 %.

3 讨 论

本研究借助Illumina测序平台对细菌的16S rDNA序列中的V3V4高变异区进行扩增分析发现，妊娠早、中、晚期合并 VVC患者的阴道微生物组成的优势菌门是厚壁菌门、放线菌门，乳杆菌属在属水平的占比最大，其次为加德纳菌属。从相对丰度大于50%为优势菌属来看,CE组26例样本的优势菌属为乳杆菌属(26/30,86.67 %),2例样本的优势菌属为加德纳菌属(2/30,6.67%)，1例为阿托波菌属(1/30,3.33 %)，1例为链球菌属、双歧杆菌属与乳杆菌属混合(1/30,3.33 %)。CM组7例样本的优势菌属为乳杆菌属(7/9,86.67 %)，1例为双歧杆菌属(1/9，1.11 %)，1例样本的优势菌属为加德纳菌属(1/9,1.11 %)。CL组30例样本中28例的优势菌属为乳杆菌属(28/30, 93.3 %)，1例样本的优势菌属为加德纳菌属(1/30,3.33 %),1例样本的优势菌属为乳杆菌属、双歧杆菌属混合(1/30，3.33 %)。个别健康孕妇出现了阴道内优势菌群为非乳杆菌、菌种多样性较高的情况,对此差异性特征还需进一步研究。

本研究还发现健康孕妇阴道内有丰度极低Anaerococcus、Corynebacterium、Dialister、Varibaculum等。这可能是不同菌种之间的竞争拮抗作用导致了某一菌种的优先定植。研究发现，多个乳杆菌种在维持阴道微生态方面发挥了重要的作用[8-10]。

本研究基于二代扩增子测序，存在无法准确分辨种水平信息的局限性，后续将逐步深入研究。另外，本研究中的阴道样本未能做到单个孕妇连续性采样,无法详细描述健康孕妇及妊娠合并VVC患者的阴道菌群动态变化特征。部分研究组获得的样本数量较少,孕中期纳入样本数量较少，可能对研究结果造成一定的偏差。

总之，VVC患者由于妊娠影响机体免疫能力，阴道内弱酸性环境破坏，优势乳杆菌显著减少，易受真菌等致病菌的侵袭[11]。本研究发现，VVC患者阴道菌群组成及比例发生了明显变化，大部分患者的乳杆菌属减少,加德纳菌属，阿托波菌属，双歧杆菌属，普氏菌属，气球菌属的比例明显增多。这些细菌丰度的改变可能与妊娠合并VVC的发生、发展以及预后有联系。