不同碘水平下甲状腺结节患者血清外泌体中miRNA生物学标志物的筛选*

曹文源,赵鸿渐,邢浩,张辉,孔伟,刘庆华,尹峰燕,何倩,邢薇佳(1.山东第一医科大学公共卫生与健康管理学院,a.研究生院,b.流行病学教研室,济南 50000;.成武县人民医院肝胆外科,山东成武 7400;3.泰安市中心医院 a.甲状腺外科,b.检验科,山东泰安 71000;4.山东第一医科大学第二附属医院 a.甲状腺外科,b.检验医学科,山东泰安 71000)

近年来随着影像学技术的发展,临床上超声检查甲状腺结节的检出率也在逐年上升,逐渐成为内分泌系统疾病中最常被检出的病理因素。然而,超声检查存在一定的缺陷,如易受粗大钙化伪影影响[1],且对医师的技术水平、临床经验等均具有较高的要求[2]。外泌体是一种可以运载miRNA及其他物质的膜性小囊泡[3],其所携带的miRNA是一类小的非编码RNA[4],可以通过调控基因表达,进而参与调控不同的生物学信号通路。因此,miRNA的改变通常能够揭示人类机体各种疾病的发展进程,有望作为肿瘤的早期标志物。此外,碘摄入量是影响成人甲状腺疾病发生发展的重要因素,研究证实,过多或过少摄入碘均与甲状腺结节的形成有关[5]。因此,本研究通过分析不同碘水平的甲状腺结节患者与健康人血清外泌体miRNA表达谱的差异,以期筛选出高灵敏且非侵入性的甲状腺结节早期诊断血清外泌体miRNA标志物。

1 材料与方法

1.1研究对象 随机选取2021年10月至2022年7月山东第一医科大学第二附属医院及泰安市中心医院甲状腺外科就诊的10例甲状腺结节患者,根据其血清碘含量分为高碘水平组和正常碘水平组,每组研究对象各5例,其中女8例,男2例,年龄(49.7±12.3)岁。纳入标准:(1)符合《2016版甲状腺结节超声指南》中规定的甲状腺结节的诊断标准;(2)年龄≥18岁;(3)智力及精神状态正常;(4)签署知情同意书。排除标准:(1)采集样本前24 h进食碘含量高的食物;(2)有原发部位肿瘤及其他部位肿瘤者;(3)合并有甲状腺炎性病变(包括慢性淋巴性甲状腺炎);(4)无血清样本。选取同期体检健康者10例,根据其血清碘含量分为高碘水平组和正常碘水平组,每组研究对象各5例,其中女3例,男7例,年龄(55.2±15.5)岁。两组间性别(χ2=0.202,P=0.653)、年龄(t=0.878,P=1.597)差异均无统计学意义。本研究获得山东第一医科大学伦理评审委员会批准(批准文号:R202211290170),所有受试对象知情同意。

1.2主要仪器及试剂 NanoDrop 2000超微量分光光度计、Invitrogen Qubit 3.0荧光计、ABI 2720 PCR扩增仪、Thermo Varioskan LUX 多功能酶标仪、Total Exosome Isolation(from serum)试剂盒、Trizol(Invitrogen原装)试剂均购自美国Thermo Fisher Scientific公司,5810R高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司),Illumina NovaSeq高通量测序平台(美国Illumina公司),双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司),芯片分析系统Agilent 2100 Bioanalyzer(美国Agilent公司),HT7700 Exalens日立透射电镜(日本Hitachi公司),ZetaView纳米颗粒跟踪分析仪(德国Particle Metrix公司),化学发光凝胶成像系统(上海勤翔科学仪器有限公司)。砷铈催化分光光度法试剂盒(武汉众生生化技术有限公司),超纯RNA提取试剂盒(江苏康为世纪生物科技有限公司),氯仿、无水乙醇(天津凯通化学试剂有限公司),无RNase水(北京索莱宝公司)。

1.3方法

1.3.1样本采集 采集各研究对象在清晨空腹条件下(禁食8 h以上)肘前静脉血5 mL置于真空管内,甲状腺结节患者于术前采集,体检健康者于体检当日采集,室温下经离心处理分离血清,取上清液并置于-80 ℃冻存。

1.3.2血清碘含量测定 按照双光束紫外可见分光光度计及砷铈催化分光光度法试剂盒说明书检测各组研究对象血清中的碘浓度。将血清碘含量为90 μg/L以上定义为高碘水平,将血清碘含量为45～90 μg/L定义为正常碘水平[6]。

1.3.3血清外泌体的提取 按照Total Exosome Isolation(from serum)试剂盒说明书提取血清中的外泌体。用100 μL PBS重悬外泌体,制成稳定悬液,置于-80 ℃冻存。

1.3.4血清外泌体的鉴定 吸取外泌体样本10 μL滴加于铜网上沉淀1 min,滤纸吸去浮液。取醋酸双氧铀10 μL滴加于铜网上沉淀1 min,滤纸吸去浮液,常温干燥数分钟,100 kV进行电镜检测成像,获得透射电镜成像结果。取冻存样本,25 ℃水浴解冻,冰上静置,用1×PBS进行稀释,样本直接用于NTA检测。

1.3.5血清外泌体miRNA的提取及高通量测序 按照超纯RNA提取试剂盒说明书提取外泌体中的总RNA,应用芯片分析系统Agilent 2100 Bioanalyzer进行质控,将质检合格的样本逆转录为cDNA,通过qPCR扩增miRNA并引入特异性标签。利用高分辨率的聚丙烯酰氨凝胶电泳纯化miRNA文库,确定文库片段大小分布,评估是否适合上机,合格样本采用Illumina NovaSeq高通量测序平台进行高通量测序。

1.3.7差异miRNA靶基因预测及生物信息学分析 使用TargetScan(http://www.targetscan.org/)、miRanda(http://www.microrna.org/)软件对差异表达miRNA进行靶基因预测。采用R包(4.1.2)clusterProfifiler软件进行GO和KEGG富集分析,分析基于差异表达分析结果中标记为up down差异miRNA的所有靶基因,通过GO富集分析,按照Cellular component(CC)、Molecular function(MF)、Biological process(BP)对呈显著差异表达的基因进行分类,揭示样本差异在基因功能上的体现,通过KEGG富集分析,推断差异miRNA靶基因所涉及的显著性富集的分子通路,进而分析其主要参与的生化代谢通路和信号转导通路。

2 结果

2.1血清外泌体鉴定 使用HT7700 Exalens日立透射电镜观察高速离心提取的血清外泌体的形态,发现在深色背景下可见圆形、类圆形且形态完整的双侧膜结构双凹圆盘状外泌体,分离的外泌体中无其他细胞成分,见图1A。纳米粒径分析显示血清外泌体平均粒径为103.2 nm,颗粒浓度约为107～1012particles/mL,见图1B。

2.2样本测序结果合并后分析的基本情况 4组样本构建miRNA文库,得到其原始reads数及经过质控修剪过滤后的clean reads数,与已知miRNA库中比对上的miRNA数量分别为高碘甲状腺结节组808个、正常碘甲状腺结节组688个、高碘健康人组1 090个、正常碘健康人组1 140个。见表1。

表1 各组测序结果合并后的基本资料

2.3各组表达共同与特异的miRNA基本情况 各组共同表达的外泌体miRNA占所有表达量的42.98%,高碘甲状腺结节组中特异表达的占总表达的2.44%,正常碘甲状腺结节组占比为2.10%、高碘健康人组占比为8.56%、正常碘健康人组占比为9.01%。见图2。

表2 高碘组和正常碘组共同差异表达miRNA的比较

图3 高碘组与正常碘组共同出现差异表达miRNA的Venn图

2.5靶基因预测及生物信息学分析 使用TargetScan和miRanda软件对差异表达miRNA进行靶基因预测,总共预测到684个靶基因。对差异表达的6个miRNA的靶标基因进行GO分析,对分析结果按照CC、MF、BP进行分类,结果显示这些差异表达的miRNA所调控的靶基因大多参与mRNA的剪接调整、细胞分化、B细胞介导的免疫调节等生物过程(图4)。对共同出现差异表达的6个miRNA目标基因进行KEGG功能注释分析,结果显示所预测的靶基因富集于多条与肿瘤关系密切的通路(如MAPK信号通路、PI3K-AKT信号通路、VEGF信号通路及NF-κB信号通路)。见表3。

表3 差异表达miRNA预测的靶基因及其富集通路

图4 靶基因的GO分析结果

3 讨论

本研究通过检测分析不同碘水平甲状腺结节患者与健康人之间血清外泌体miRNA的差异表达,发现miR-324-5p、miR-6511b-3p、miR-9903、miR-550a-3p、miR-5001-3p、miR-3688-3p这6个miRNA在甲状腺结节患者中的表达水平明显下调,提示上述差异miRNA有望作为甲状腺结节的潜在生物学标志物。

碘水平的高低不仅仅会影响甲状腺疾病的发生发展,也会影响miRNA在人体内的表达,例如Wang等[7]的研究发现,高碘会影响miR-422a,导致其表达下调,进而负调控MAPK1的表达,促进甲状腺肿瘤的生长。还有学者提出,甲状腺疾病的诊断基础是基于准确的甲状腺功能检测而言的,而在碘缺乏或者碘过量的情况下都会影响甲状腺功能检查,进而影响临床医师对疾病的判断[8]。基于这些研究,笔者有理由怀疑不同碘水平甲状腺结节患者在进行检查时所需的外泌体miRNA生物学标志物可能不同,为了简化外泌体miRNA应用于临床检验时的步骤,本研究分析了6个在不同碘水平下均呈差异表达的miRNA,有望成为无论是高碘患者还是正常碘患者均适用的血清外泌体miRNA生物学标志物。

本研究通过分析差异表达外泌体miRNA参与调控的相关通路,发现miR-324-5p的靶基因主要富集于VEGF信号通路,与本研究发现类似,Yang等[9]发现在发生淋巴结转移的甲状腺乳头状癌患者中miR-324-5p通过VEGF信号通路诱导HUVEC侵袭/迁移和巨噬细胞M2极化,从而参与了甲状腺乳头状癌的进展。此外,另有研究证实,miR-550a-3p在乳腺癌患者体内表达降低,其进一步通过机制研究发现,miR-550a-3p可以通过抑制Ras/ERK通路中2个关键效应因子ERK1和ERK2的表达,从而发挥抑癌作用[10],提示在甲状腺结节患者中miR-550a-3p可能发挥了同样的作用,然而,其具体的机制仍需要进一步的实验加以验证。

综上所述,笔者通过分析不同碘水平人群中血清外泌体差异miRNA的共同交集表达,初步筛选出6个可以作为鉴别不同碘水平甲状腺结节患者和健康人的潜在生物学标志物。然而,本研究存在一定局限性,一是检测的样本较少,尚不能明确其临床诊断效能;二是qRT-PCR的结果也仅能说明所筛的miRNA表达量较高,不存在因为表达量过低而导致血清中无法检出的情况。因此,未来仍需要进一步扩大样本量,以证明其潜在的诊断效能及临床应用价值。