姜黄素纳米硒的制备工艺优化、表征及其对酒精性肝损伤的保护作用

黄文浩，陈建平,2, ，陈博文，陈 岑，钟赛意,2，刘晓菲,2，李 瑞,2，宋兵兵,2，汪 卓,2

（1.广东海洋大学食品科技学院，广东省水产品加工与安全重点实验室，广东省海洋生物制品工程实验室，广东省海洋食品工程技术研究中心，水产品深加工广东普通高等学校重点实验室，广东省亚热带果蔬加工科技创新中心，广东湛江 524088；2.大连工业大学，海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心，辽宁大连 116034）

酒精性肝损伤（Alcoholic liver injury，ALI）是临床上最为常见的肝病之一，主要由长期或大量摄入酒精引起。ALI 最初表现为酒精性脂肪肝、肝炎，进而演变成肝纤维化、肝硬化和肝癌[1]。据世界卫生组织统计，每年全球约有300 万人因酒精中毒死亡，在我国，随着酗酒人口的比例不断上升，ALI 的防治变得尤为重要[2-3]。近年来，具有低毒副作用的食源性天然物质因在抗酒精性肝损伤领域存在巨大潜力而备受关注[4]。

姜黄素（Curcumin，Cur）是从姜科植物根茎中提取的一种疏水性多酚类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗癌和护肝等生物活性[5]。研究表明，Cur 可以改善由酒精、四氯化碳等化学物质诱导的肝损伤，是一种防治肝损伤的理想天然化合物[6-7]。然而，Cur 的水溶性差，进入人体后存在难吸收、高浓度下生物利用度极低等问题，严重限制了其在酒精性肝损伤防治领域的应用[8-9]。为提高Cur 的生物利用度，人们通过多种方法对Cur 进行改性，其中，用药物载体对Cur 进行包裹是可行的方法之一[10]。目前，常用的药物载体有脂质体、微球、纳米粒、环糊精和乳剂等，它们都具有载体用量少、药物荷载量高、粒径和渗透力可控、释放药物速率可控、毒性低、副作用少等优点[11]。然而，脂质体作为药物载体存在靶向效果不理想、稳定性欠佳等问题。同时，微球靶向给药系统也存在药物的突释等未解决的问题。而纳米技术作为近年来发展的一种新型技术，在生物学领域有着广泛的应用。其中，硒纳米粒子（粒子粒径在1～100 nm之间）因具有体积小、比表面积大、物理化学性质独特、对人体细胞毒性低等优点，被广泛用作药物载体[12]。

硒（Selenium，Se）是人体维持正常生理活动必需的微量元素，而常见的有机Se 和无机Se 的有益剂量和有害剂量的范围很窄，当Se 摄入过量时，会对人体产生毒害作用[13-14]。随着纳米技术的出现，研究发现，将Se 纳米化制备得到的纳米硒（Selenium nanoparticles，SeNPs）具有低毒性和高生物活性[15-16]。然而，SeNPs 存在表面能高、不稳定、在水溶液中容易聚集等问题导致其生物活性低[17]，限制了它的临床应用。设想如果采用Cur 作为稳定剂制备姜黄素纳米硒（SeNPs@Cur），这样既能结合Cur 和SeNPs 的优点，又能克服两者本身存在的不足[18]。故本研究通过化学还原法合成SeNPs@Cur，运用单因素实验和响应面试验对SeNPs@Cur 的制备条件进行优化，并对其进行结构表征和抗酒精性肝损伤的作用研究，为Cur 在防治酒精性肝损伤临床药物的应用开发提供新的技术手段和数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

亚硒酸钠（Na2SeO3，＞98%）美国Sigma 公司；姜黄素（Cur，＞95%）、抗坏血酸（VC，＞99%）中国上海源叶生物科技有限公司；胎牛血清、PBS、DMEM高糖培养基、0.25%胰蛋白酶溶液、双抗溶液 美国Gibco 公司；LO2 细胞 美国 ATCC 公司。

AUW120 电子天平 日本岛津公司；HL-6 数显恒温水浴锅 常州奥华仪器有限公司；Zetasizer Nano ZSE 马尔文纳米粒度电位仪 上海马尔文帕纳科公司；N-4000 旋转蒸发仪 东京理化器械株式会社；FD8508 真空冷冻干燥机 韩国Ilshin 公司；TU-1901 双光束紫外可见分光光度计 北京谱析通用仪器有限责任公司；Agilent 7500Cx 电感耦合等离子体质谱 美国Agilent 公司；MIRA LMS 扫描电子显微镜 捷克TESCAN 公司；Oxford 能谱仪 英国牛津仪器集团；NicoletiS-5 型傅里叶变换红外光谱仪、Varioskan Flash 全自动酶标仪 美国Thermo公司；JIDI-21D 高速离心机 广州吉迪仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 SeNPs 的制备 称取79.26 mg VC和7.78 mg Na2SeO3分别溶解于22.5 mL 蒸馏水中，在Na2SeO3溶液中加入0.25 mL 无水乙醇后与VC溶液混合，将混合液置于34 ℃度恒温水浴锅中加热并搅拌反应1.98 h，反应后的混合液用0.5 kDa 的透析袋透析48 h，得到SeNPs 溶液。

1.2.2 SeNPs@Cur 的制备

1.2.2.1 单因素实验 参考Chen 等[19]方法，对SeNPs@Cur 的制备工艺参数略作修改。VC和Na2SeO3分别溶解于22.5 mL 蒸馏水中，在Na2SeO3溶液中加入0.25 mL Cur 无水乙醇溶液后与VC溶液混合，将混合液置于恒温水浴锅中加热并搅拌反应，反应后的混合液用0.5 kDa 的透析袋透析48 h，得到SeNPs@Cur 溶液。固定VC:Na2SeO3摩尔比为10:1，反应时间为2 h，反应温度为35 ℃，采用马尔文纳米粒度电位仪考察不同Cur 浓度（2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL）对SeNPs@Cur 粒径的影响；固定Cur 浓度为6.0 mg/mL，反应时间为2 h，反应温度为35 ℃，采用马尔文纳米粒度电位仪考察不同VC:Na2SeO3摩尔比（4:1、6:1、8:1、10:1、12:1）对SeNPs@Cur 粒径的影响；固定Cur 浓度为6.0 mg/mL，VC:Na2SeO3摩尔比为10:1，反应温度为35 ℃，采用马尔文纳米粒度电位仪考察不同反应时间（1、2、3、4 和5 h）对SeNPs@Cur 粒径的影响；固定Cur 浓度为6.0 mg/mL，VC:Na2SeO3摩尔比为10:1，反应时间为2 h，采用马尔文纳米粒度电位仪考察不同反应温度（25、30、35、40、45 ℃）对SeNPs@Cur粒径的影响。

1.2.2.2 响应面优化试验 在单因素实验的基础上，以Cur 浓度（A）、VC:Na2SeO3摩尔比（B）、反应时间（C）和反应温度（D）四个因素为变量，SeNPs@Cur 粒径（Y）为因变量设计响应面试验，试验设计的因素与水平见表1。使用Design-Expert 13 软件分析多因素的交互作用，确定SeNPs@Cur 的最佳制备工艺参数。根据最佳工艺参数制备SeNPs@Cur 溶液，经透析、旋蒸、真空冷冻干燥后得SeNPs@Cur。

1.2.3 SeNPs@Cur 载药率的测定 称取5.0 mg Cur溶于50.0 mL 无水乙醇，经超声充分溶解后，将Cur溶液稀释至1、2、4、6、8、10 μg/mL，在425 nm 处测定其吸光度值，得到Cur 标准曲线y=0.1569x-0.0083，R2=0.9998。

称取5.0 mg SeNPs@Cur 样品溶于50.0 mL 无水乙醇，经超声充分溶解后，在425 nm 处测定其吸光度值，根据Cur 标准曲线得到样品中的Cur 含量，按公式（1）计算载药率。

1.2.4 SeNPs@Cur 的结构表征

1.2.4.1 电感耦合等离子体质谱（Inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）取SeNPs@Cur粉末100.0 mg 置于消解液中（6.0 mL 硝酸+0.5 mL双氧水）进行微波消解，随后使用ICP-MS 测定样品中的Se 含量。仪器工作参数为：入射功率1550 W，载气流量1.0 L/min，辅助气流量1.0 L/min，氦气流量4.0 L/min，进样深度10.0 mm，进样速率1.0 L/min。

1.2.4.2 扫描电子显微镜（Scanning electron microscope，SEM）取微量SeNPs@Cur 粉末样品均匀粘贴于导电胶上，使用溅射镀膜仪对其进行喷金处理，工作电流为10 mA，喷涂时间为45 s，随后用扫描电子显微镜在不同放大倍数下对SeNPs@Cur 样品形貌进行拍摄，拍摄加速电压为3 kV。

1.2.4.3 傅里叶变换红外光谱仪（Fourier transform infrared spectrometer，FT-IR）取约2.0 mg SeNPs@Cur 粉末样品与200 mg 干燥的溴化钾（KBr）粉末混合后研磨均匀，将混合粉末进行压片处理，压制成半透明薄片，扫描其红外吸收光谱，扫描波数范围为4000～400 cm-1。

1.2.4.4 能谱仪（Energy dispersive spectrometer，EDS）

在上述实验方法1.2.4.2 的样品条件下，使用能谱仪对样品进行能谱mapping 元素分析，拍摄时加速电压为15 kV。

1.2.5 SeNPs@Cur 对乙醇损伤LO2 细胞的保护作用

1.2.5.1 细胞培养 LO2 细胞复苏后，在37 ℃、5%CO2的培养箱中，培养于含10%胎牛血清和1%双抗溶液的DEME 高糖培养基，待细胞密度＞70%时进行传代，取对数生长期的细胞用于后续实验。

1.2.5.2 乙醇诱导LO2 细胞损伤模型的建立 将细胞悬液稀释至8×104个细胞/mL，在96 孔板中，对照组和实验组加入细胞悬液，空白组加入含10%胎牛血清和1%双抗溶液的DEME 高糖培养基，每孔100 μL。培养24 h 后去除培养液，实验组加入乙醇浓度为200～1400 mmol/L 的DEME 高糖培养基，空白组和对照组加入DEME 高糖培养基，每孔200 μL。分别培养3 h 和6 h 后，各孔加入20 μL 5 mg/mL MTT 溶液孵育4 h，去除上清液，各孔加入150 μL DMSO 溶液反应10 min。采用酶标仪检测各孔在570 nm 处的吸光值，根据公式（2）计算细胞活力。

式中：A0表示空白组OD 值；A1表示对照组OD 值；A2表示实验组OD 值。

1.2.5.3 SeNPs@Cur 对乙醇诱导LO2 细胞损伤的影响 将细胞悬液稀释至8×104个细胞/mL，在96孔板中，对照组和实验组加入细胞悬液，空白组加入含10%胎牛血清和1%双抗溶液的DEME 高糖培养基，每孔100 μL。培养24 h 后去除培养液，实验组加入SeNPs@Cur 浓度为125～500 μg/mL 的DEME高糖培养基，空白组和对照组加入DEME 高糖培养基，每孔100 μL。培养12 h 后去除上清液，实验组加入乙醇浓度为800 mmol/L 的DEME 高糖培养基，空白组和对照组加入DEME 高糖培养基，每孔200 μL。培养6 h 后，各孔加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液孵育4 h，然后去除上清液，各孔加入150 μL DMSO 溶液反应10 min。采用酶标仪检测各孔在570 nm 处的吸光值，根据公式（2）计算细胞活力。

1.3 数据处理

运用SPSS 26.0 软件对数据结果进行统计学分析，Design-Expert 13.0 进行响应面模型建立及分析，Origin 2021 进行图片绘制。实验设置3 个重复，实验数据均以平均值±标准差（D）表示。

2 结果与分析

2.1 Cur 浓度、VC:Na2SeO3 摩尔比、反应时间和反应温度对SeNPs@Cur 粒径的影响

据报道，Cur 的加入可以使SeNPs 具有更高的稳定性[20]。为确定Cur 的最佳浓度，考察不同Cur浓度对粒径的影响，结果如图1A 所示。SeNPs@Cur 粒径大小随Cur 浓度的增加呈先下降后上升的趋势，在Cur 浓度为6.0 mg/mL 时粒径达到最小值为（101.18±1.71）nm。结果表明，适量的Cur 可抑制SeNPs 的聚集，使SeNPs@Cur 粒径减小。这可能是Cur 中的酚羟基可以吸附并包裹SeNPs，阻止了SeNPs 的聚集，从而使得粒径减小。而过量的Cur则易导致Cur 分子之间聚集使得游离的酚羟基减少，导致吸附和包裹SeNPs 的能力减弱，从而使得SeNPs@Cur 粒径增大。因此，选择6.0 mg/mL 作为Cur 的最佳浓度。

过量的VC可以使Na2SeO3完全反应，有助于SeNPs 的合成[19]。为确定最佳VC:Na2SeO3摩尔比，考察不同VC:Na2SeO3摩尔比对粒径的影响，结果如图1B 所示。当VC:Na2SeO3摩尔比为4:1 时，所制得SeNPs@Cur 的粒径为（121.93±3.86）nm，提高两者摩尔比到10:1 时，SeNPs@Cur 的粒径最小，为（106.38±0.83）nm，这主要是因为过量的VC可以改善晶核的生长从而稳定SeNPs@Cur[21]，然而，继续增大VC:Na2SeO3摩尔比会导致粒径变大，这可能是VC浓度进一步增大会使得反应体系不稳定，从而导致纳米颗粒增大。因此，选择10:1 作为VC:Na2SeO3的最佳摩尔比。

反应时间是影响Na2SeO3还原成SeNPs 的一个重要参数[22]。过短的反应时间会导致VC和Na2SeO3之间反应不完全，反之，长时间反应会导致SeNPs 的聚集进而使粒径增大。为确定最佳反应时间，考察不同反应时间对粒径的影响，结果如图1C 所示。当反应时间为2 h 时，所制得SeNPs@Cur 粒径为（103.65±1.74）nm，达到最小值。当反应时间超过2 h，所制得SeNPs@Cur 粒径显著增大（P＜0.05）。因此，选择2 h 作为最佳反应时间。

升高反应温度会加剧分子的热运动，使SeNPs粒子更容易分散[23]。为确定最佳反应温度，考察不同反应温度对粒径的影响，结果如图1D 所示。在25～35 ℃内，随着反应温度增加，SeNPs@Cur 粒径呈减小趋势，当反应温度为35 ℃时，所制得SeNPs@Cur 粒径显著性减小为（103.92±3.70）nm（P＜0.05）。然而，当温度进一步提高时，SeNPs@Cur 粒径显著增大（P＜0.05）。这可能是由于高温容易导致纳米颗粒剧烈运动，从而增加碰撞的机会和强度导致纳米粒子不断的聚集，最终使得粒径增大[24]。因此，选择35 ℃作为最佳反应温度。

2.2 响应面优化SeNPs@Cur 的制备工艺

以Cur 浓度（A）、VC:Na2SeO3摩尔比（B）、反应时间（C）和反应温度（D）为变量，SeNPs@Cur 粒径（Y）为因变量，进行响应面优化试验设计，方差分析结果见表2。使用Design-Expert 13 软件分析4 个因素对SeNPs@Cur 粒径的影响，得SeNPs@Cur 粒径（Y）的二次回归方程：Y=101.35+1.07A-4.29B-0.2C+1.84D-3.92AB-4.64AC+0.63AD+0.06BC-1.99BD-4.42CD+11.31A2+9.65B2+14.28C2+4.14D2。

表2 二次回归模型的方差分析Table 2 ANOVA for quadratic model

由表2 中的二次回归模型方差分析结果可知，模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P=0.7855＞0.05），决定系数R2=0.9759，说明模型拟合效果好，可信度高，该模型可用于对SeNPs@Cur 粒径的预测。回归模型中一次项B 和D，交互项AB、AC 和CD，二次项A2、B2、C2和D2极显著（P＜0.01），一次项A 显著（P＜0.05）。

由表2 可知，Cur 浓度与VC:Na2SeO3摩尔比、Cur 浓度与反应时间、反应时间与反应温度之间存在显著的交互效应（P＜0.05），其余的交互项不显著。图2 是根据回归方程生成的响应面立体图，其反映了Cur 浓度、VC:Na2SeO3摩尔比、反应时间和反应温度四者之间的相互作用。由图可知，各因素间的曲线较陡峭，等高线呈椭圆形，说明因素间的交互作用对SeNPs@Cur 粒径影响较大[25]，SeNPs@Cur 粒径在各因素设置水平范围内随着因素的增大呈先减小后增大的趋势。

图2 Cur 浓度与VC:Na2SeO3 摩尔比（A）、Cur 浓度与反应时间（B）、反应时间与反应温度（C）的交互作用对SeNPs@Cur 粒径影响的响应面图Fig.2 Response surface plots of the interactions of Cur dosage and molar ratio of VC to Na2SeO3 (A),Cur dosage and reaction time (B),reaction time and reaction temperature (C) on SeNPs@Cur particle size

使用Design-Expert 13 软件对模型最小值进行求解，得到SeNPs@Cur 最优制备条件为：Cur 浓度5.92 mg/mL、VC:Na2SeO3摩尔比10.39:1、反应时间1.98 h、反应温度34.00 ℃，模型预测该条件下所制得的SeNPs@Cur 粒径为100.72 nm。为验证模型预测结果，实际设置Cur 浓度5.92 mg/mL、VC:Na2SeO3=10.39:1、反应时间1.98 h、反应温度34.00 ℃进行SeNPs@Cur 粒径的验证实验，在此条件下制得的SeNPs@Cur 粒径为（100.79±3.46）nm，接近理论预测值，说明模型可靠，因此使用该条件制备SeNPs@Cur 进行后续实验。对SeNPs@Cur 进行载药率和Se 含量的测定，结果显示，SeNPs@Cur 的载药率为12.80%±0.80%；ICP-MS 测得样品中Se 含量为23.32%±0.07%，与Jiao 等[26]得到的结果接近。

2.3 SeNPs@Cur 的表征

2.3.1 SEM 考察SeNPs@Cur 的形貌 采用SEM观察SeNPs、Cur 和SeNPs@Cur 的表面形貌，结果如图3 所示。SeNPs 呈现为不规则颗粒聚集物，表明SeNPs 易聚集，分散性较差[19]（图3A）。Cur 则呈长条状，分布杂乱（图3B）。而SeNPs@Cur 呈分散球形（图3C），这与Yu 等[27]制备的SeNPs@Cur 形态类似，表明SeNPs 经Cur 修饰后能够有效抑制其聚集，从而提高SeNPs 的分散性。

图3 SeNPs（A）、Cur（B）和SeNPs@Cur（C）的SEM 图（2000×）Fig.3 SEM images of SeNPs (A),Cur (B) and SeNPs@Cur (C) (2000×)

2.3.2 SeNPs@Cur 的红外光谱分析结果 为了确定SeNPs 与Cur 之间的结合方式，运用傅里叶变换红外光谱对SeNPs@Cur 进行分析，结果如图4 所示。SeNPs 的红外光谱图几乎没有吸收峰，这与陈雪花等[28]得到的结果一致。在3505、1599、1508、1458、1281 cm-1分别对应苯环上的羟基伸缩振动，苯环上碳碳双键伸缩振动，羰基伸缩振动，碳氢键在结构平面内的弯曲振动，芳香环的羰基伸缩振动，均为Cur 的特征吸收峰[27,29]。而SeNPs@Cur 与Cur的峰形极其相似，无新的吸收峰产生，且羟基吸收峰的强度变弱，波数从3505 cm-1红移到3412 cm-1，这可能是由于Cur 中的酚羟基与SeNPs 表面的Se 原子之间的发生了类似氢键的相互作用（O-H···Se）所致。综上所述，Cur 主要通过酚羟基吸附结合在SeNPs 表面。

图4 Cur、SeNPs 和SeNPs@Cur 的红外光谱图Fig.4 FTIR spectra of Cur,SeNPs and SeNPs@Cur

2.3.3 SeNPs@Cur 的表面元素分析 采用EDS 对SeNPs@Cur 进行表面元素分析，结果如图5 和表3 所示。由图5 可知，SeNPs 和SeNPs@Cur 中均检测出C、O 和Se 三种元素，但对应的峰强度不同。由表3 可知，SeNPs 的Se、C、O 含量分别为88.02%、10.81%、1.14%，元素含量占比中大部分是Se[30]。而在SeNPs@Cur 中，C、O 含量分别从SeNPs的10.81%和1.14%提高到48.51%和5.41%，增加的C 和O 主要是来源于Cur，可推断SeNPs 成功负载了Cur。

图5 SeNPs（A）和SeNPs@Cur（B）的SEM-EDS 元素分析Fig.5 SEM-EDS element analysis of SeNPs (A) and SeNPs@Cur (B)

表3 SeNPs 和SeNPs@Cur 的表面元素组成Table 3 Surface element composition of SeNPs and SeNPs@Cur

2.4 SeNPs@Cur 对乙醇损伤LO2 细胞的保护作用

由图6A 可知，LO2 细胞经不同浓度的乙醇处理不同时间后，细胞活力随着乙醇浓度的增加呈下降趋势，且乙醇作用6 h 的细胞活力低于3 h。在乙醇浓度为800 mmol/L，对LO2 细胞作用6 h 时，细胞活力下降至51.39%±6.02%，达到中度损伤。故后续实验选择800 mmol/L 乙醇对LO2 细胞作用6 h 作为乙醇诱导LO2 细胞损伤模型。

图6 不同浓度乙醇对LO2 细胞活力（A）、SeNPs@Cur 对乙醇损伤LO2 细胞活力（B）和细胞形态（C）的影响Fig.6 Effects of different concentrations of ethanol on the cell viabilities of LO2 cells (A) and SeNPs@Cur on the cell viabilities (B)and cell morphology (C) of LO2 cells damaged by ethanol

由图6B 可知，模型组LO2 细胞经800 mmol/L乙醇作用6 h 后，细胞活力从空白组的100%±3.05%显著下降至58.06%±0.43%（P＜0.05），表明乙醇处理导致细胞出现了损伤。当细胞经125、250、500 μg/mL 的SeNPs@Cur 进行干预后，细胞活力得到了显著性提升，分别从模型组的58.06%±0.43%提高至71.43%±1.39%、77.33%±3.54%、85.41%±4.61%，表明SeNPs@Cur 能够显著改善乙醇诱导的肝细胞损伤，且呈现出浓度依赖性。而且，在不同浓度下，SeNPs@Cur 处理后的细胞活力均高于Cur 处理组和SeNPs 处理组，表明SeNPs@Cur 对乙醇诱导的肝细胞损伤的保护作用强于单独处理的Cur 和SeNPs，这可能是由于Cur 经SeNPs 负载后大大提高了Cur 的生物利用度，同时SeNPs 经Cur 修饰后避免了SeNPs 的聚集，从而提高了SeNPs@Cur 的护肝活性。为了验证上述结果，进一步观察了不同样品处理对细胞形态的影响，结果如图6C 所示。由图6C 可知，相比于空白对照组，用乙醇处理细胞后，细胞数量明显减少，且细胞形态呈圆形。而用500 μg/mL SeNPs@Cur 处理后，能够显著提高细胞数量，且细胞形态呈不规则的多边形，与空白对照组的细胞形态相似，这说明SeNPs@Cur 能够改善乙醇诱导的肝细胞损伤，这一结果与细胞活力的实验结果（图6B）相一致。

3 结论

本研究通过单因素实验及响应面试验对SeNPs@Cur 的制备条件进行了优化，并对其进行了结构表征和抗酒精性肝损伤的作用研究。结果表明，SeNPs 的最佳制备工艺参数为Cur 浓度5.92 mg/mL、Vc:Na2SeO3摩尔比10.39:1、反应时间1.98 h 和反应温度34.00 ℃，在此条件下制备的SeNPs@Cur 粒径为（100.79±3.46）nm，接近模型的理论预测值。进一步对其进行结构鉴定发现，Cur 通过酚羟基吸附结合在SeNPs 表面形成均一球形的纳米粒子，从而使得SeNPs 分散性得到提高。抗酒精性肝损伤研究发现，相比单独的Cur 和SeNPs，SeNPs@Cur 对乙醇损伤LO2 细胞表现出更强的保护作用，说明Cur 经SeNPs 负载后能够增强Cur 对乙醇诱导LO2 细胞损伤的保护作用。综上所述，采用SeNPs 负载Cur是一种提高Cur 生物利用度的有效途径，为SeNPs@Cur 在酒精性肝病的防治领域提供了数据参考和理论支持。