微塑料污染对东太平洋鲣肌肉组织代谢的潜在影响

吴丽军，潘 钟，李伟文*，戴小杰，何韦宜，黄 浩，欧丹云，王 磊

(1.上海海洋大学海洋科学学院，上海 201306；2.自然资源部第三海洋研究所，福建 厦门 361005)

微塑料(Microplastics，MPs)是指直径小于5 mm的塑料颗粒，已被发现在陆地、近海、公海、极地以及人迹罕至的深渊等区域[1-4]，也普遍存在于鱼类[5-6]、贝类[7]、藻类[8]等水生生物体内[9-10]。MPs污染生物体的区域大多在近海沿岸地区，对海洋生物的毒理效应主要通过贻贝、藻类、鱼类和哺乳动物等的生理实验来体现[10]。已有研究表明，在太平洋东南部鱼类养殖实验室养殖的292条浮游鱼类幼体中，有6条被检测出MPs[11]；东太平洋海域(5°～12° S、120°～140° W)15条鲯鳅(Coryphaenahippurus)中检测出139个MPs[6]；巴西东南部鲣(Katsuwonuspelamis)的MPs检出率为25.8%[12]。鲣是全球可供渔业贸易的6种金枪鱼之一，占全世界商业金枪鱼捕获量的60%，有较高的商业价值，是人类远洋捕捞的首要目标渔业物种。

相关研究表明，MPs可能影响鱼类的生长发育[13]，激发氧化应激反应[14]，扰乱新陈代谢[15]，并导致组织损伤和炎症反应[16]，影响繁殖质量和生长速率变化[17]。鲣可通过呼吸或摄食等方式摄入MPs，若要研究MPs对其生理的影响，需从其内部机制进行探索[18]。代谢组以生物体内小分子代谢物为研究对象[19]，通过分析内源性代谢物在生物体内相对含量的变化，揭示细胞受环境污染物MPs刺激后产生的各种内源性生理和生化反应，不仅能直接准确地反映MPs对生物体生理状态造成的影响，也能从整体水平分析生物体的代谢平衡状况，该技术已被广泛应用于生命科学和毒理学等诸多科学领域[20-21]，如利用代谢组学检测海洋鱼类的肝脏[22]、肌肉[23]或肠道组织[24]，以研究MPs对大洋鱼类的代谢反应。

本研究选取东太平洋海域部分鲣的肌肉组织为研究对象，通过超高效液相色谱-质谱联用仪(UHPLC-Q-TOF MS)开展非靶向代谢组学分析，获取显著性差异代谢物的数量和代谢通路等信息，再通过文献查询与综合对比分析，逐一剖析获取的差异代谢物和代谢通路富集可能导致的目标鲣的行为、生物生理等特征变化，综合探讨MPs污染对东太平洋鲣的潜在影响，以期为海洋鱼类的毒理学研究提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

研究所用样本为2020—2021年捕捞自东太平洋海域 (5°～12° S、120°～140° W)的部分鲣。经生物样品预处理和MPs鉴定后，随机选取3尾在肌肉组织未检测到MPs的鲣(SKJ1～SKJ3)和3尾在肌肉组织检测到MPs的鲣(SKJ4～SKJ6)进行代谢组学分析。用于代谢组学分析的样本均取自臀鳍到尾部之间的肌肉。为实现良好的重复性，将获得的对照组和实验组的3尾鲣的肌肉各均质成1个混合样。用于代谢组学分析的鲣生物学信息如表1所示。

1.2 实验方法

本实验以在肌肉组织未检测到MPs的鲣为对照组、在肌肉组织检测到MPs的鲣为实验组，每组设3个平行样本，每个样本取样量为1.000 g。通过样本制备、样品超高效液相色谱-质谱联用(UHPLC-Q-TOF MS)检测、数据分析等步骤[25]，探究MPs污染对东太平洋鲣代谢产物的影响。

1.2.1 样本制备

在4 ℃环境下缓慢解冻样本，取适量样本加入至预冷甲醇/乙腈/水溶液(2∶2∶1，V/V)，涡旋混合，低温超声 30 min，-20 ℃静置10 min，14 000 g、4 ℃离心 20 min，取上清液真空干燥；质谱分析时加入100 μL乙腈水溶液(乙腈∶水=1∶1，V/V)复溶，涡旋，14 000 g、4 ℃离心 15 min，取上清液进样分析。

1.2.2 质谱检测

样品经Agilent 1290 Infinity LC 超高效液相色谱系统(UHPLC)分离后，用Triple TOF 6600 质谱仪(AB SCIEX)进行质谱分析。考虑到代谢产物需要离子化后才能被质谱检测，而依据化合物性质结构的不同，有些物质在电离时容易带正电荷，有些容易带负电荷，因此本研究选用电喷雾电离(ESI)正离子和负离子模式进行检测。

1.2.3 数据分析

1)单变量统计分析

用R XCMS软件包对检测到的所有代谢物进行差异倍数(Fold change，FC)分析和T检验。其中，FC> 1.5 或 FC<0.05为差异代谢物，P<0.05为显著。本研究在标准数据库[26]中搜索，以确认代谢物鉴定的质量。通过对色谱保留时间和分子量信息与当地数据库进行匹配，从而对生物样品中的代谢物进行结构鉴定。

2)多维统计分析

OPLS-DA 模型得到的变量权重值——变量投影重要度(Variable importance for the projection，VIP)能够被用于衡量各代谢物的表达模式对各组样本分类判别的影响强度和解释能力，挖掘具有生物学意义的差异脂质分子。通常 VIP>1的代谢物被认为在模型解释中具有显著贡献，VIP值越大，变量投影越重要。

1.2.4 富集通路分析

京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析是以KEGG通路为单位，通过Fisher精确检验(Fisher’s exact test)，分析计算各个通路代谢物富集度的显著性水平，从而确定受到显著影响的代谢和信号转导途径。P值越小，则该代谢通路的差异性越显著。

2 结果与分析

2.1 鲣摄食MPs后部分代谢产物发生显著变化

鲣肌肉组织的UHPLC-Q-TOF MS非靶向代谢组学结果显示，与对照组相比，实验组的代谢物发生了显著变化。本研究以VIP>1和P<0.05为标准，筛选出具有显著差异的代谢物，分析显示共有34个代谢产物发生显著性差异，其中19个差异代谢物上调、15个差异代谢物下调，结果如表2、表3所示。

表2 正离子模式显著性差异代谢物Tab.2 Metabolites with significant differences in positive ion pattern

表3 负离子模式显著性差异代谢物Tab.3 Metabolites with significant differences in negative ion pattern

续表3

在正离子模式下，最为显著的差异代谢物为甘油磷酸胆碱，其VIP值为23.095；其次为1-硬脂酰-sn-甘油3-磷酰胆碱，其VIP值为16.139。在负离子模式下，最为显著的差异代谢物为顺-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸，其VIP值为52.529；其次为左肌肽，其VIP值为26.018。

差异代谢物中，1-硬脂酰-sn-甘油3-磷酰胆碱(P=0.000)、磷酸肌酸 (P=0.002)、20-羟基花生四烯酸(P=0.003)、1，2-二十二碳六烯酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(P=0.004)和尿酸(P=0.004)具有极显著差异(P<0.01)，其中20-羟基花生四烯酸(FC=6.002)和尿酸(FC=6.263)的差异表达倍数最高。

2.2 显著性差异代谢产物的富集通路分析

KEGG通路富集结果表明，差异代谢物主要富集于新陈代谢、胆汁分泌、丙酸酯代谢、近端小管碳酸氢盐回收、乙苯降解、甘油磷脂代谢和胆固醇代谢，其中甘油磷脂代谢富集程度最显著(P=0.00)；其次为丙酸酯代谢(P= 0.01)、新陈代谢(P= 0.02)。

图1显示了显著性差异代谢物的7个富集通路，其中丙酸代谢(丙酸、甲基丙二酸)、胆固醇代谢(牛黄胆碱盐)、胆汁分泌(尿酸、牛黄胆碱盐)和乙苯降解(丙酸)通路中所有鉴定到的代谢物的表达趋势均为上调；近端小管碳酸氢盐回收代谢通路中鉴定到的苹果酸代谢物的表达趋势为下调；甘油磷脂代谢通路中，3种代谢物(磷酰胆碱、3-磷酸甘油、甘油磷酸胆碱)表达为上调，1种代谢物(1-硬脂酰-2-油酰-sn-甘油3-磷酸胆碱)表达为下调；新陈代谢通路中，7种代谢物表达为上调(磷酸肌酸、尿酸、磷酰胆碱、3 -磷酸甘油、甲基丙二酸、丙酸、牛磺胆酸盐)，5种代谢物(α-D-半乳糖-1-磷酸、左肌肽、苹果酸、甜菜碱、1-硬脂酰-2-油酰-sn-甘油3-磷酸胆碱)表达为下调(表4)。

注：气泡图中每个气泡代表一个代谢通路(选择P值显著性最高的前 20 条)；气泡所在横坐标和气泡大小表示该通路在拓扑分析中的影响因子大小；气泡所在纵坐标和气泡颜色表示富集分析的 P 值(取负常用对数，即-lg P)，颜色越深 ，P 值越小，富集程度越显著。Notes:Each bubble in the bubble diagram represented a metabolic pathway (selecting the top 20 with the highest P-value significance);the horizontal coordinate of the bubble and the bubble size indicated the influence factor size of the pathway in the topological analysis;the vertical coordinate of the bubble and the bubble color indicated the P-value of the enrichment analysis (selecting the negative common logarithm,i.e.-lg P),the darker the color,the smaller the P-value,then the more significant the enrichment.

表4 富集通路中的显著性差异代谢物Tab.4 Significant differential metabolites in the enrichment pathway

3 讨论

3.1 代谢产物差异对鲣生理行为的影响分析

3.1.1 微塑料污染对鲣的消极影响

本研究中：1)甲基丙二酸(VIP=4.363；FC=2.230；P= 0.012)和丙酸(VIP=2.136；FC=2.076；P=0.017)表达量显著上调。甲基丙二酸是由甲基丙二酰辅酶a突变酶而形成，其逐渐积累可诱发甲基丙二酸血症，会损伤神经[27-28]。丙酸过多会导致生物线粒体病[29]。丙酸中毒可造成神经系统损伤和脑结构异常，表现为发育迟缓和运动障碍等，与胃肠道疾病也有一定的关联性[30]。因此，对鲣等鱼类而言，丙酸表达量的上调可能是导致其游泳速度下降和活动减缓的主要原因。2)磷酸胆碱(VIP=5.719；FC=1.974；P=0.010)表达量显著上调。磷酸胆碱是一种重要的神经递质，参与神经信号的传递，在鱼类的神经系统中发挥着重要的作用。磷酸胆碱是磷脂的组成部分，参与脂肪代谢过程，可能通过影响鱼类的脂肪合成、分解和利用，而影响体内脂肪的积累和能量代谢。也有研究表明，磷酸胆碱和尿酸可诱导生物体动脉炎症[31]。3)尿酸(VIP=1.627；FC=6.263；P=0.004)表达量显著上调，其差异倍数高达6.263倍。尿酸是一种抗氧化物质，能够中和体内的自由基，减轻氧化应激的损害，因而可帮助鲣等鱼类应对氧化应激，保护细胞免受氧化损伤；此外，还参与了鱼体内水盐平衡的调节，可能通过影响鱼体的尿液产生和排泄，对鱼类的体液平衡和渗透调节起重要作用。4)苹果酸(VIP=5.457；FC=0.654；P=0.048)表达量显著下调，这可能与鲣对氧化应激的适应性反应有关。MPs摄入可能导致氧化应激的增加，因塑料中的化学物质和微生物污染可能产生自由基而引发氧化反应，导致细胞和组织受损。苹果酸的下调还可能与鲣的免疫功能受损有关。摄入的MPs可能干扰鲣的免疫系统功能，使免疫调节异常，增加感染疾病的风险。有研究表明，苹果酸表达量下调可引起溶藻弧菌相关疾病[32]。因此，苹果酸的表达量下调可能反映了免疫系统对这种异常状态的一种抑制或不足的反应。5)20-羟基花生四烯酸(P=0.003，FC=6.002)表达量显著上调。20-羟基花生四烯酸主要以磷脂的形式存在于细胞膜上，是一种生物体必需的不饱和脂肪酸[33]，也是一种炎症反应介质，其上调可能反映了鲣体内的炎症反应增加。摄入的MPs可能激活鲣免疫系统，导致炎症反应的加剧。长期或过度的炎症反应可能对鲣的组织和器官功能产生负面影响[34]。

3.1.2 甘油-3-磷酸、磷酸肌酸和羟基积雪草苷对鲣的消极影响具有可逆性

本研究中：1)甘油-3-磷酸和磷酸肌酸是与能量代谢密切相关的化合物，参与肌肉的能量储存和释放过程，其表达量的显著变化可能会影响鲣的能量代谢能力，导致能量供应不足或调节失衡[35]。鲣摄食MPs后，其代谢产物磷酸肌酸(VIP=1.258；FC=3.671；P=0.002)的表达量显著上调。磷酸肌酸的主要作用是在肌肉收缩期间向肌纤维提供额外的高能磷酸基团。通过增加磷酸肌酸的含量，鱼类的肌肉能够更有效地储存和释放能量，从而增强肌肉的收缩力和耐力。另外，肌肉中的肌酸可产生磷酸肌酸，保护神经元免受氧化应激的影响[36]。2)羟基积雪草苷(VIP=1.539；FC=2.097；P= 0.034)的表达量显著上调。羟基积雪草苷表达量的显著变化可能会破坏鲣的细胞保护机制，增加细胞受损的风险，导致炎症反应和细胞损伤的增加。这是因为羟基积雪草苷是一种具有抗氧化和抗炎作用的物质，其表达量的显著上调可减少活性氧的产生，下调促炎基因和蛋白质的表达[37]，减轻小胶质细胞介导的神经炎症[26]，是鲣为应对MPs积累的自身保护机制，表明MPs对海洋鱼类的消极影响具有可逆性。

需要注意的是，MPs对鲣的具体影响可能受到摄入量、暴露时间、塑料类型和个体差异等因素制约。此外，鲣的生理适应和代谢机制是多维的，受到的影响因素也很多。因此，MPs对鲣的影响是一个复杂的问题，还需更进一步的科学研究，以解析其对鲣及其他生物的潜在风险和影响机制。

3.2 差异代谢物通路富集

3.2.1 胆固醇代谢

本研究中，鲣肌肉组织的代谢产物牛磺胆酸盐(VIP=2.135；FC=4.777；P= 0.019)表达量显著上调；KEGG富集分析表明牛磺胆酸盐处于胆固醇代谢通路中。牛磺胆酸盐是一种胆汁酸，在胆固醇代谢中发挥着重要的作用，包括胆固醇合成、吸收、运输和排泄等，其上调可能促进胆固醇的合成和代谢，提高胆固醇的合成速率。这可能导致鲣体内胆固醇水平的升高，影响胆固醇代谢的平衡。有研究表明，海洋青鳉(Oryziasmelastigma)[38]和鲤 (Cyprinuscarpio)[39]摄食MPs后的胆固醇代谢显著上调，本研究与之相符合。

3.2.2 甘油磷脂代谢

KEGG富集分析表明，鲣摄食MPs后，其差异代谢物主要富集于甘油磷脂代谢。甘油磷脂是一种复杂脂类，参与细胞膜的建立和维持，帮助鱼类适应水环境温度、盐度和压力[40-41]，以及参与细胞信号传导，而代谢物的富集可能干扰甘油磷脂的代谢和合成，从而影响细胞内的信号传导通路，这可能导致鲣的生理调节和细胞功能发生异常，导致鲣抵抗病毒侵染的功能减弱[42-43]。此外，甘油磷脂也与能量代谢相关，参与脂肪酸合成和降解等过程，而代谢物的富集可能影响甘油磷脂代谢通路的平衡，导致能量代谢紊乱。这可能对鲣的能量获取和利用产生影响，从而对其生长和发育不利。摄入MPs后引起的代谢物富集于甘油磷脂代谢通路，可能导致细胞损伤、氧化应激和炎症反应，使鲣的健康出现状况，并对生态系统产生负面影响。

3.2.3 乙苯降解

本研究的差异代谢物中丙酸(VIP=2.136；FC=2.076；P=0.017)表达量显著上调。丙酸及丙酸盐均处于乙苯降解的代谢通路中，乙苯是一种有机污染物，其降解产物可能具有毒性[44]。丙酸在乙苯降解途径中的富集可能是鲣对乙苯毒性的代谢反应。乙苯降解代谢路径是一种氧化降解过程，可提供额外的能量来源，因此丙酸富集会影响鲣的能量获取和利用，对其生长和生理状态产生影响。丙酸参与多种生物化学过程，包括酸碱平衡、糖代谢和脂肪酸合成等，因此丙酸的上调会对鲣的生理功能、生长和发育产生影响，同时丙酸表达量的上调和富集于乙苯降解可能反映了鲣在面临MPs污染时的适应机制。

3.2.4 丙酸代谢

本研究表明，差异代谢物显著富集于丙酸代谢(P=0.01)，甲基丙二酸(VIP=4.363；FC=2.230；P= 0.012)和丙酸(VIP=2.136；FC=2.076；P=0.017)的表达量均显著上调。该结果与Lu X等[45]的罗非鱼(Oreochromisniloticus)模型实验的结果相符合。丙酸是一种短链脂肪酸，是大脑代谢的主要能量来源，作为酸性代谢产物，参与维持鲣体内的酸碱平衡，其上调可能是鲣对于MPs摄入后酸碱平衡的调节反应，维持丙酸平衡有利于生物体正常的生命活动[46]，过量的丙酸积累可能导致鲣酸中毒。另外，丙酸代谢过程中产生的氢离子可引起氧化应激，导致细胞内氧化损伤，因此丙酸代谢也会提高鲣体内氧化应激水平，对细胞和组织产生损害。此外，丙酸还参与鲣的多种生理调节过程，如血糖调节和脂肪酸合成等。丙酸表达量的上调也反映了鲣体内代谢途径的调节和重新分配，MPs对其生理功能、生长和发育也产生了影响。

3.2.5 近端小管碳酸氢盐回收

本研究表明，鲣摄食MPs后，其差异代谢物富集于近端小管碳酸氢盐回收，苹果酸处于近端小管碳酸氢盐回收代谢通路中。苹果酸在鲣体内参与酸碱平衡的调节。本研究中，苹果酸(VIP=5.457；FC=0.654；P=0.048)的表达量显著下调，可能影响鲣体内的酸碱平衡能力，导致酸中毒或碱负荷增加。碳酸氢盐回收通路参与维持鲣体内酸碱平衡和离子稳态，而苹果酸的富集可能是鲣为了抵御MPs污染对酸碱平衡的影响而调节代谢途径。近端小管是肾脏的重要部分，参与尿液的重吸收和排泄，苹果酸富集于近端小管碳酸氢盐回收代谢通路可能反映了鲣肾功能的调节，但苹果酸表达量的下调会影响鲣体内近端小管的功能，对尿液的成分调节产生影响。

3.2.6 胆汁分泌

本研究表明，差异代谢物富集于胆汁分泌，该结果与Hou M等[47]的稀有鲫(Gobiocyprisrarus)模型实验的结果相符合。牛磺胆酸盐是胆汁的重要成分，参与脂肪消化和吸收过程。本研究中，牛磺胆酸盐(VIP=2.135；FC=4.777；P=0.019)表达量的显著上调和富集于胆汁分泌代谢通路可能反映了鲣对MPs摄入的消化适应，这对鲣的脂肪消化和吸收能力产生影响，从而对能量获取和生长发育造成影响。尿酸是一种抗氧化剂，具有清除自由基和保护细胞免受氧化损伤的作用。本研究代谢物中，尿酸(VIP=1.672；FC=6.236；P=0.004)表达量的显著上调可能是鲣为应对MPs污染引起的氧化应激反应而产生的一种适应机制，尿酸的增加可能有助于减轻鲣体内的氧化损伤，并保护其细胞和组织的健康。胆汁分泌和胆道系统的正常功能对于消化和排泄过程至关重要。牛磺胆酸盐和胆汁分泌代谢通路的富集可能反映了鲣肝脏和胆道系统的调节，但过度的胆汁分泌可能导致胆汁酸过度排泄，对肝脏和胆道系统产生负面影响。

4 结论

本文通过UHPLC-Q-TOF MS和非靶向代谢组学技术，对鲣肌肉组织的代谢产物进行鉴定，探讨了MPs污染对东太平洋鲣肌肉代谢水平的扰动情况，并进行差异代谢物分析和代谢通路富集分析，以期为研究MPs污染对海洋鱼类的毒理学提供理论依据。研究结果表明，鲣肌肉受到MPs污染后，其代谢产物甲基丙二酸和丙酸、甘油-3-磷酸、磷酸肌酸和羟基积雪草苷等上调，苹果酸等下调。差异代谢物的显著表达可引发新陈代谢、胆汁分泌、丙酸酯代谢、近端小管碳酸氢盐回收、乙苯降解、甘油磷脂代谢和胆固醇代谢功能的异常。但本文仅从代谢组产物差异分析探索MPs对鲣的潜在影响，缺乏验证实验，因此在后续研究中，将通过控制变量的方法验证其影响。