紫花苜蓿中黄酮类化合物分离及特殊显色反应研究

＊赵 静

（甘肃工业职业技术学院 甘肃 741025）

黄酮类化合物是一类天然存在于植物中的多酚化合物，具有多种生物活性，其具有抗氧化、抗炎症、抗癌等多种药理活性，对人类健康和植物生长具有积极影响。黄酮类化合物的分离和鉴定，对于理解紫花苜蓿的药用价值以及牧草属性具有关键意义。分离和鉴定紫花苜蓿中的黄酮类化合物通常需要复杂的分析技术，包括色谱学和质谱学等本研究旨在分离和鉴定紫花苜蓿中的黄酮类化合物，以及开发一种特殊显色反应，用于定量分析这些化合物。这项研究将有助于深化对紫花苜蓿中潜在药用成分的了解，同时提供了一种有力的技术手段，以促进相关研究以及药物开发。

1.紫花苜蓿植物材料的准备

（1）植物采集。在紫花苜蓿植物材料的采集过程中，研究人员选择了生长在适宜环境下的植株。采集时间被严格控制在紫花苜蓿的生长季节内，以保证样本的最佳状态。采集工作中，研究人员使用锋利的剪刀和修枝工具，以最小化对植物的伤害[1]。为了确保后续实验的可行性和可重复性，研究人员采集了足够数量的植物材料，并在采集过程中特别注意保持样本的完整性。

（2）样品制备。在样品制备阶段，研究人员从采集得到的植物材料中精心选择了健康且未受病虫害侵害的样本。在制备过程中，研究人员对植物材料进行了彻底的清洁，去除了土壤、尘埃和其他杂质，以确保样本的纯度。随后，植物材料被精确地切割成适当大小的碎片或块，为后续的分析和提取工作做好准备。每个样本都被仔细标识，包括采集日期、采集地点和植物部位等关键信息，这些标识将帮助研究人员追溯样品来源，保证实验数据的准确性和可信度。

2.黄酮类化合物的分离和富集

(1)萃取方法

①提取。将样品加入适量的提取溶剂，如乙醇或甲醇（通常是10～20mL），然后加入盐酸（HCl）以维持酸性条件。此酸性条件有助于提高黄酮类化合物的溶解度。研究人员通常在室温下使用声波震荡或超声波浴加速提取，提取时间控制在15～30min。使用离心机分离上清液，上清液中含有黄酮类化合物。

②固相萃取（SPE）。准备SPE柱，典型的SPE填料是硅胶或C18柱，这些填料有助于吸附和分离黄酮类化合物。

在SPE柱上预先平衡，使用纯溶剂如甲醇或乙醇。将上清液（提取液）通过SPE柱，使黄酮类化合物被吸附到SPE填料上。

③洗脱。使用适当的洗脱溶剂（醚或乙酸乙酯）冲洗SPE柱，将黄酮类化合物从填料中洗出，将洗脱液收集并浓缩。

④浓缩。使用氮气吹扫或旋转浓缩仪将洗脱液浓缩到适当的体积，通常是几毫升。在浓缩液中添加内标物质，以用于定量分析，确保准确性[2]。将浓缩的样品转移到色谱管或瓶中，以便进行进一步的色谱分析或定量测定。

(2)分离和富集方法

①柱色谱技术。研究人员将植物样品磨碎并适当称量，以获得准确的起始样品质量。选择适当的柱填料，通常是硅胶（SiO2）或C18填料。这些填料具有吸附性，可以用于分离黄酮类化合物。在使用柱之前，需要对柱进行预处理，通常使用纯溶剂如甲醇或乙醇平衡柱。将制备好的样品以溶解在适当的溶剂中的形式加载到柱上，样品中的黄酮类化合物将与填料相互作用，并被吸附在柱上。通过使用不同极性的溶剂（通常是醚或乙酸乙酯），可以洗脱吸附的黄酮类化合物，从而分离它们。

②液液萃取。液液萃取是一种基于化合物在不同相间分配行为的有效分离和富集黄酮类化合物的方法。其关键步骤包括样品制备，选择适当的有机溶剂（例如乙醚或乙酸乙酯），样品提取，离心分离过程，有机相（含黄酮类化合物）和水相（含其他杂质）分离。其中，萃取率的计算公式为：

有机相中含有目标黄酮类化合物，需要将其收集到另一个容器中，随后通过氮气吹扫或旋转浓缩仪对其进行溶剂蒸发，将提取物浓缩至适当的体积。这个过程利用液液相互作用将目标化合物从植物样品中分离出来，为后续的分析和研究提供了富集的样品。其中，富集倍增计算公式为：

为确保液液萃取过程中不会出现缺少溶剂的情况，在开始萃取之前，研究人员需要准确计算溶剂消耗效率，其公式为：

(3)黄铜色素纯化

黄铜色素的纯化作为一种化学分离过程，通常采用柱层析技术。在这一过程中，使用特定的溶剂系统，即展开剂，以分离黄铜色素及其他组分。展开剂的选择是关键因素，它通常包括多种有机溶剂或其混合物，如乙酸乙酯、丙酮和甲醇[3]。这些溶剂的选择取决于黄铜色素和其他化合物的相对亲和力和极性，通过调整它们的比例和性质，可以调控色素与柱填料之间的相互作用，实现不同成分的有效分离。

在柱色谱中，用于描述和控制黄铜色素移动的重要概念是Rf值（色素移动率）。Rf值是移动距离与溶剂前移距离之比，用公式（4）表示。

式中，Rf值是展开剂对移动速率和位置的影响的反映。通过比较黄铜色素与其他化合物的Rf值，可以评估它们之间的分离程度，并确定黄铜色素的位置。在实验中，研究人员进行标准柱色谱实验，测量黄铜色素相对于展开剂的Rf值，然后根据Rf值的大小，可以确定黄铜色素的位置和分离情况，从而进行有效的纯化和收集。其中，不同溶剂的展开效果如表1所示。

表1 不同展开剂的展开效果

3.黄酮色素的紫外光谱分析

（1）实验过程。为了进行紫外光谱分析，需要使用分光光度计。在分析前，分光光度计需要经过校准，并设置适当的参数，包括波长范围和检测器灵敏度。黄酮色素在紫外光区域（200～400nm）吸收较强，因此需要将分光光度计扫描范围设定在这一区间。这个范围的选择允许研究人员获取有关黄酮色素吸收特性的详细信息。随着波长的扫描，分光光度计会测量样品对不同波长光线的吸光度。吸光度是光线经过样品后被吸收的量，通常以A（吸光度）表示。这些吸光度数据被记录下来，构成吸光度光谱[4]。在获得吸光度光谱后，研究人员可以进行进一步的分析。通过观察光谱的形状和吸收峰的位置，可以推测黄酮色素的结构和化学性质。吸光度的最大值对应着黄酮色素的最大吸收波长，这是其特征性质之一。

（2）实验结果。本次研究中，工作人员选择分离效果较好的单一黄色谱带，在溶液中加入乙醇，并使用超声波进行过滤，对经过超声波过滤的溶液进行甲醇溶解，并以甲醇作为参比在200～600nm波长范围内进行紫外光谱对比，将该溶液与其他类型同类化合物甲醇溶液进行UV光谱对比，通过这种方式得到黄酮类化合物结构类型（详见表2）。

表2 不同黄酮类化合物类型甲醇溶液UV光谱

（3）结果分析。根据所提供的UV光谱数据，对于不同黄酮类化合物的吸收特性进行了观察和比较（如图1所示）。

图1 紫花荀蓿中黄酮色素的光谱图

UV光谱是一种用于分析物质吸收光线的光学技术，由于不同化合物具有不同的吸收特性，因此可以通过观察它们的光谱来推断其结构。在这个情况下，考察的是紫花首蓿中的黄酮类化合物。根据所提供的UV光谱数据，可以得出以下结论：

①黄酮类化合物的吸收特性通常在两个波段范围内被观察到，分别是带Ⅰ（300～400nm）和带Ⅱ（240～280nm）。这两个波段代表不同的电子跃迁，其中带Ⅱ通常对应着芳香环的π-π跃迁，而带Ⅰ通常对应着非芳香环的n-π跃迁。

②黄酮和黄酮醇的UV吸收光谱表现出相似的特征，都在带Ⅰ（300～400nm）和带Ⅱ（240～280nm）范围内显示吸收峰。这些化合物的带Ⅰ吸收峰红移，即峰值在较长波长处。这可能是由于它们的芳香环结构引起的[5]。

③异黄酮和二氢黄酮的UV吸收光谱在带Ⅰ和带Ⅱ范围内表现出一些不同。对于异黄酮，带Ⅱ是主要吸收峰，而带Ⅰ则是较弱的峰。相比之下，二氢黄酮的带Ⅱ也是主要吸收峰，但其带Ⅰ与带Ⅱ相比更弱。

综合以上观察，紫花首蓿中的黄酮类化合物的UV光谱数据显示出与异黄酮类化合物相似的特性。这是因为异黄酮的UV吸收光谱在带Ⅰ为弱峰，带Ⅱ为主峰的特点。因此，基于UV光谱数据的比较，可以得出结论：紫花首蓿中的黄酮类化合物的结构为芒柄花素的异黄酮类化合物。

4.结语

本次研究中，研究人员使用了多种化学技术，例如色谱分离、质谱分析和紫外光谱分析，以识别和分离黄酮类化合物。这些分析方法不仅帮助研究人员确定了紫花苜蓿中的黄酮类化合物的存在，还提供了有关它们的结构和性质的重要信息。通过了解这些化合物的结构，研究人员可以更好地理解其生物活性和潜在药用价值。特殊显色反应的研究也为研究人员提供了一种便捷而敏感的方法，用于检测和测定黄酮类化合物。黄酮类化合物的特殊显色反应也为快速、准确地检测这些化合物提供了一种新途径，有望在药物研究、生态监测和植物保护等领域发挥重要作用。