基于AIE分子-适配体探针的银离子检测研究

＊金嘉杰 胡超 殷康 纪川 牛俊峰 孙海亚*

（1.浙江科技学院 生物与化学工程学院 浙江 310023 2.浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室 浙江 310023）

随着中国经济的快速发展，人口增长、工业化和城镇化的快速推进，重金属相关行业保持着较强的发展势头，而由此带来的重金属污染压力正在不断增加，尤其是在“十三五”期间，重金属污染已成为中国正面临的严峻环境问题[1,2]。现代工业的快速发展，使得工业生产带来的重金属污染越来越严重。它们可以通过皮肤、消化道、呼吸道等途径进入到人和动物体内，对生物的生命健康产生了极大的影响[3]。重金属离子的危害性主要表现为，能与人体内的多种蛋白质及酶产生强烈的相互作用，导致其变性失活。并且重金属离子还在人体内进行累积，一旦重金属离子的含量超出了人体的耐受极限，就会引起人体不同程度的中毒，给人带来极大的伤害[4]。近年来中国学者对国内众多水系进行了镉、铅、汞含量测定，结果表明，水质中的重金属含量均有超标的现象[5]。另外，在日本水俣湾附近，含汞的工业废水被排放到海水中。甲基汞由废水中的无机汞转化而来，并通过生物积累进入食物链，最终被人摄取，使人生病，成为全世界关注的水俣病[6]。

表1 饮用水标准中对常见重金属的上限要求Tab.1 Upper limit requirements for common heavy metals in drinking water standards

随着重金属污染不断加重，在提倡从根源上控制重金属污染产生的同时，许多针对环境重金属污染的检测方法被提出并广泛应用。目前，传统的重金属检测方法主要有光谱法和电化学法，这些方法都有相同的不足就是操作复杂，成本高，且不能快速得到检测结果，简单、高效、低成本的重金属检测技术逐渐凸显出它的重要性。随着各学科领域的技术进步，多门学科整合并被利用到检测技术当中，检测技术逐渐走向多元化。如利用核酸适配体构建传感器系统用于检测[7]等。

1990年，美国的Gold[8]和Szostak[9]两个研究小组先后独立提出了核酸适配体（Aptamer）的概念，这是一种高特异性、高亲和力的单链寡核苷酸，从人工合成的随机寡核苷酸序列库中筛选出来，具有能与靶分子（重金属离子）特异性结合的特性，其长度一般在10 100个核苷酸[10]。利用核酸适配体的高特异性，建立一套针对特定物质的，高灵敏度的生物传感检测新方法。既能获得较为优异的分析效果，又能保证操作方法的简便性。同时，核酸适配体因其特殊的寡核苷酸特性，更易于对其进行结构改造，并能特异性地与多种靶标分子精准结合。由核酸适配体与多种现代分析检测技术相结合得到的生物传感器[11,12]，再配合上生物信号放大技术，就能够构建出一套具有巨大应用潜力的高灵敏度检测体系。

阳离子型聚集诱导发光分子是一种具有AIE特性的阳离子有机盐，由具有AIE性质的四苯基乙烯[13]及4-吡啶甲醛组合而成。常规的荧光分子因其平面性及较强的分子间相互作用，其在单一分散时呈荧光，当其聚集时，分子的荧光强度会出现降低，甚至会导致荧光猝灭发生[14]，这就是所谓的“聚集猝灭荧光”（Aggregation-Caused Quenching，ACQ）。ACQ现象严重制约了有机发光材料的应用，而AIE分子则不会有这样的问题。经过结构研究和试验验证，发现AIE分子的发光原理与ACQ分子截然不同，目前研究认为引起AIE分子固态发光的主要因素是分子内运动受限（Restriction of Intramolecular Motions，RIM），包括分子内转动和振动受限。当分子聚集时，会消耗分子激发态能量的分子内运动被抑制，这极大地抑制了分子猝灭时的非辐射跃迁。此时，分子以辐射跃迁为主要方式释放能量，分子发光[15]。这种特性为荧光检测提供了条件，可以将AIE分子结合到生物大分子上以获得高强度的荧光效果。在AIE分子聚集后，聚集物发出的荧光迅速增强，利用此特性，可以实现对特定物质含量进行直接的、定量的检测。同时，AIE的发现为解决发光材料在聚集后发光性能衰退的问题提供了新的途径，开辟了有机发光材料研发的新领域。基于上述结果，2017年中国科学最高奖“国家自然科学一等奖”授予中国香港科技大学唐本忠院士带领的团队，奖励他们在“聚集诱导发光”研究领域做出的世界领先科研成果[16,17]。目前，AIE材料已经在生物检测与成像等研发领域取得巨大突破，生物细胞成像[18]、诊断治疗[19]、细胞示踪[20]、致病菌鉴别与检测[21]等利用AIE材料的新兴技术被广泛运用于医疗事业当中。

本项目拟采用适配体技术与聚集诱导发光技术相结合的新方法用于水溶液中银离子的检测。目标建立一套全新的具有高选择性的且能够快速、定量检测水溶液中重金属离子浓度的方法，并提供一套针对银离子的专一性AIE 适配体复合探针体系及成熟的制备方法。

1.试验部分

(1)主要原料、试剂和试验设备

表2 主要原料和试剂Tab.2 Main raw materials and reagents

表3 主要试验仪器Tab.3 Main experimental instruments

(2)阳离子型AIE分子的合成

AIE材料的分子结构如图1。引用文献的合成方法：2,4 二甲基四苯基乙烯经NBF、BPO催化能够生成2,4二溴甲基四苯基乙烯，经亚磷酸三乙酯催化反应后，能与吡啶苯基甲醛进行反应生成特定的四苯基乙烯衍生物，将该衍生物与RX进行取代后即可获得试验所需的阳离子型AIE分子。对所得产物结构进行表征，其结果如下：1H-NMR(500MHz,DMSO,δ):8.85(d,4H,Pyridine H),8.18(d,4H,Pyridine H)，7.92～7.01(m,22H,Ar-H,-CH=CH-)。结果与参考文献[22]报道一致。

图1 阳离子型AIE分子Fig.1 Cationic AIE molecule

(3)溶液的配制

①缓冲液配制

称取4.000g氢氧化钠，溶解在100mL超纯水中，配置成浓度为1×10-3mol/L的氢氧化钠溶液。将0.5950g的4-羟乙基哌嗪乙磺酸固体溶于400mL超纯水中，并用配好的NaOH溶液调节pH值，使溶液在25℃时的pH为7.4±0.1，最后以超纯水稀释，定容至500mL。配置HEPES缓冲液。

②溶液配制

将阳离子型AIE分子（8.20mg）溶于50mL超纯水中，转移定容至100mL，配置成浓度为1×10-4mol/L的阳离子型AIE分子溶液。将装有定制核酸适配体的离心管置于离心机中，以转速4000rpm离心1min，加入353μL配置好的Tris溶液，配置成浓度为1×10-4mol/L的核酸适配体的HEPES溶液。两溶液均在4℃冰箱冷藏保存。

取一定量配置好的阳离子型AIE分子溶液与核酸适配体溶液混合，稀释在HEPES缓冲溶剂中，配成AIE分子浓度为1×10-5mol/L，核酸适配体浓度为1×10-6mol/L的荧光探针溶液。

取10μL浓度为0.1mol/L的硝酸银溶液，稀释到1000μL，配置成浓度为1×10-3mol/L的稀硝酸溶液，密封避光存储。

(4)光谱测试

①紫外光谱测定

将一定浓度的阳离子型AIE溶液以及AIE分子与适配体呈一定配比的荧光探针溶液分别在Hepes溶液中分散均匀，振荡3mim，装入比色皿中，室温下测试其吸收光谱，记录最大吸收峰波长数。扫描范围在200～800nm。

②荧光光谱测定

基于紫外光谱测得的最大吸收峰波长数，对荧光探针分子及探针体系进行多项荧光光谱检测。试验中仪器的激发波长为390nm，扫描范围在410～750nm，激发狭缝和发射狭缝宽度均为5nm。

将一定浓度的阳离子型AIE样品在5mLVTHF：VH2O=9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9、1:19、1:99的溶液中分散均匀，振荡3min，装入比色皿中，室温下测试其发射光谱。

将不同浓度梯度的阳离子型AIE分子溶液与固定浓度的核酸适配体溶液在Hepes溶液中分散均匀，振荡3min，装入比色皿中，室温下测试其发射光谱，并找出复合探针体系中适配体浓度与阳离子型AIE分子浓度的最佳配比。

(5)重金属离子的检测

①复合探针体系与不同浓度Ag+相互作用的荧光强度变化的检测。依次取一定剂量的AgNO3溶液加入2mL复合探针溶液中混合均匀，振荡3min，测定不同银离子浓度下，复合溶液的最大荧光强度的变化情况。

②其他金属干扰离子对复合探针体系与Ag+离子相互作用的干扰情况检测。分别配置10倍于银离子浓度的Na+、K+、Mg2+、Al3+、Cd2+、Pb2+、Hg2+、Ca2+、Cr3+、Fe3+、Zn2+、Mn2+、NH4+的金属离子水溶液，并与银离子溶液等比例混合。取相同剂量的上述金属离子混合溶液加入到2mL复合探针溶液中混合均匀，振荡3min。比较各组溶液荧光强度变化的差异程度，分析不同的金属干扰离子是否会对复合探针体系与Ag+的特异性结合带来干扰。

(6)探针检测限的计算

复合探针体系对Ag+离子的检测限（LOD）根据公式（1）计算：

式中：σ表示不加Ag+离子时空白探针体系（阳离子型AIE分子浓度为1.6×10-5mol/L，核酸适配体浓度为1×10-6mol/L）的荧光强度标准偏差；k表示探针在线性范围（0.011～0.540mg/L）内的斜率。

2.结果与讨论

(1)阳离子型AIE分子与复合探针分子的AIE性质

图2（a）为阳离子型AIE分子的吸收光谱与荧光光谱图。相关结果如下：在200 ～800nm吸收光谱扫描范围内，阳离子型AIE分子的最大吸收峰对应波长为390nm，摩尔消光系数为2.631×106mol·L-1·cm-1，吸收波段覆盖300～500nm，表明分子对近紫外光和蓝紫色可见光有较好的吸收。以390nm作为检测仪器的激发波长，将激发和发射的狭缝宽度均设定为5nm，收集荧光光谱图上波长410～750nm扫描范围内的数据并分析。阳离子型AIE分子在波长为580nm左右的位置有最大发光强度峰，发光颜色接近红色，Stokes位移为190nm。较大的Stoke位移可避免生物大分子自发光和入射光对荧光发射的影响。

图2 阳离子型AIE分子的吸收光谱与荧光光谱（a）及在不同THF/H2O比例溶液中AIE分子的最大发光强度变化图（b）Fig.2 Absorption spectrum and fluorescence spectrum of cationic AIE molecule(a) and variation of maximum fluorescence intensity of AIE molecules in solutions with different THF/H2O ratios(b)

图2（b）为AIE分子在不同THF/H2O比例溶液中的最大发光强度变化图。本课题的阳离子型AIE分子在作为良性溶剂的水中发出微弱的光或不发光，但是随着溶液中作为不良溶剂的四氢呋喃（Tetrahydrofuran，THF）的比重不断增加，荧光分子的荧光强度显著增强。由图3可见，在纯水溶液中，样品的荧光强度极弱。在THF体积分数低于50%时，溶液的荧光强度随不良溶剂比例的增大而显著增大，但始终较低。在THF体积分数高于50%后，荧光分子的聚集程度逐渐达到最大，荧光分子在580nm处的发光强度缓慢增强并最终趋于稳定，溶液保持着较大的荧光强度，这一现象与文献报道一致[23]，这正是AIE分子特有的荧光性质，阳离子型AIE分子在水中溶解性较好，在四氢呋喃中溶解性较差，因此随着溶液中THF的比例不断升高，阳离子型AIE分子发生聚集，自身运动受阻，从而使得荧光强度显著增强。

图3 阳离子型AIE分子浓度对复合荧光探针体系最大发射强度的影响Fig.3 the effect of the concentration of cationic AIE molecules on the maximum fluorescence intensity of the composite fluorescent probe system

(2)AIE探针与单链适配体的相互作用

图4为阳离子型AIE分子浓度对复合荧光探针体系最大发射强度的影响变化图。如图4所示，向核酸适配体溶液中加入阳离子型AIE分子溶液（016μmol/L）时，随着阳离子型AIE分子浓度的增加，复合体系的荧光强度稳步增强。阳离子型AIE分子溶液的浓度在超过16μmol/L后，其荧光强度变化不大，且受限于阳离子型AIE分子在水中的溶解度，复合荧光探针体系的荧光强度有所下降。这说明此时阳离子型AIE分子与核酸适配体通过静电复合作用的结合，已达到饱和，即AIE分子与核酸适配体的最大结合比趋向于16:1。所以，选定阳离子型AIE分子浓度为16μmol/L，核酸适配体的浓度为1μmol/L的探针溶液作为标准复合荧光探针体系，用于后续对探针与银离子相互作用情况的关系探究。

图4 复合荧光探针体系在加入银离子后最大发射强度的变化情况Fig.4 Changes in the maximum fluorescence intensity of the composite fluorescent probe system after the addition of silver ions

(3)AIE-适配体复合探针对银离子的检测

①银离子的定量检测

加入不同浓度梯度的银离子后，荧光探针体系的荧光强度迅速降低。经多次试验测试发现，在3min左右，探针体系的荧光强度降至最低水平并且保持恒定的荧光强度。这说明对于复合荧光探针体系来说，核酸适配体可以准确地与银离子结合，同时释放出阳离子型AIE分子，导致荧光猝灭发生，溶液荧光强度下降。另外也说明，该复合荧光探针体系对重金属Ag+离子的检测能力良好且快速，最后将检测时间定位为3min[24]。

图5为复合荧光探针体系在加入银离子后最大发射强度的变化情况。分析图中数据可以看出，复合荧光探针体系的荧光强度随着银离子质量浓度的增加而逐渐减弱。在银离子质量浓度低于0.011mg/L时，探针体系的荧光强度整体下降偏快，而在银离子质量浓度高于0.011mg/L时，复合探针体系荧光强度稳定下降。从线性拟合的结果来看，当银离子质量浓度高于0.011mg/L时，探针体系荧光强度与银离子质量浓度具有良好的线性关系（R2=0.9897）。另外，基于实验数据，可推算出该体系对银的最低检出限（LOD）为0.010mg/L，该LOD值低于生活饮用水卫生标准的最低值，这为快速高效地检测生活饮用水中的重金属银离子含量的实际应用奠定了基础。

图5 复合荧光探针体系选择性干扰测试的最大发射强度比Fig.5 Maximum fluorescence intensity ratio for selective interference testing of composite fluorescent probe systems

②复合探针体系的选择性检测

为了检验复合探针体系对银离子的特异性识别能力，选取了一些废水中常见的金属离子对复合荧光探针体系的选择性进行干扰性试验检测，结果见图5。将10倍于银离子浓度的干扰金属离子溶液与银离子溶液等比例混合，这些金属离子包括Na+、K+、Mg2+、Al3+、Cd2+、Pb2+、Hg2+、Ca2+、Cr3+、Fe3+、Zn2+、Mn2+、NH4+。取一定量金属离子混合溶液加入到2mL复合探针体系中，充分振荡混合，比较各组溶液荧光强度的数值大小。从图5可以看出，除了铅与汞离子以外，大多数常见金属离子对复合探针体系的荧光强度干扰不大，充分说明该复合荧光探针体系对银离子的检测具有良好的选择性。

3.结论

本文通过多步合成，制备了阳离子型AIE分子。然后将其与定制的核酸适配体通过静电作用组合，配制成了一种具有AIE效应的复合荧光探针体系。该探针体系在核酸适配体的浓度为1μmol/L，AIE探针浓度为16μmol/L时达到最大结合比。在加入银离子后，该复合体系中的核酸适配体会优先和银离子发生特异性结合，释放出阳离子型AIE荧光分子，从而导致AIE分子发生荧光猝灭，使体系荧光强度降低。利用此特性，可以实现对待测样本溶液银离子浓度的定量检测。复合探针体系对Ag+的检测限为0.010mg/L，线性范围为0.011～ 0.540mg/L，对银离子的检测具有较好的选择性，较低的检测限以及较宽的检测范围。同时，实验结果也证明了大部分其他的金属离子对银离子的检测干扰程度较小，因此具有在自然环境水体中实际应用的潜力。本工作为利用AIE技术快速高效地检测日常用水中的重金属Ag+离子含量的实际应用奠定了基础。