PI3K/Akt/FoxO1信号通路对人源肺动脉平滑肌细胞及肺动脉高压大鼠细胞凋亡的影响

高璐阳 金旗,2 张毅,3 李欣 黄志华 章思铖 段安琪 赵智慧 赵青 罗勤

(1.中国医学科学院 北京协和医学院 国家心血管病中心 阜外医院 呼吸与肺血管病诊治中心,北京 100037;2.复旦大学附属中山医院 上海市心血管病研究所心内科,上海 200032;3.电子科技大学附属四川省人民医院重症监护科,四川 成都 610072)

肺动脉高压(pulmonary hypertension,PH)是一种常见的血流动力学异常状态、严重的心血管疾病,可累及全身多个系统。其特征为肺动脉压异常升高、肺血管阻力不断增加,导致肺血管重构,并损害右心泵血能力,最终可能导致右心衰竭和死亡[1]。由于现有的靶向药物主要作用于舒张血管通路,因此,有必要探索发病机制,以发现直接针对肺动脉重构的治疗目标[2]。有研究[3]证实,阻止肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cell, PASMC)凋亡在肺动脉重构中起重要作用。有研究[4]显示,磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)信号通路在细胞生长、增殖、凋亡、侵袭和迁移等多个病理生理过程中起重要作用,并与血管重构密切相关。在该信号通路中,叉头框蛋白O1(forkhead box protein O1, FoxO1)是Akt的下游目标蛋白。研究[5]表明,FoxO1在肺血管中的表达水平降低可能引发肺血管重构。因此,笔者提出了“PI3K/Akt信号通路可能通过下调转录因子FoxO1抑制PASMC凋亡”的科学假设。笔者计划从细胞和动物水平进行研究,以探究PI3K/Akt/FoxO1信号通路在PH发病机制中的作用,并希望找到新的治疗靶点。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

人源肺动脉平滑肌细胞(human pulmonary artery smooth muscle cell, hPASMC)购自美国模式培养物集存库,货号PCS-100-023。使用的试剂包括胰酶-乙二胺四乙酸、磷酸盐缓冲液、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体和抗小鼠抗体、二喹啉甲酸蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天公司),胎牛血清(GIBCO公司,美国),平滑肌细胞培养基(Sciencell公司,美国),野百合碱(monocrotaline, MCT)(Sigma公司,美国),Bcl-2抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶抗体、Akt抗体、磷酸化Akt抗体、PI3K抗体(Proteintech公司,美国),裂解的胱天蛋白酶3(cleaved caspase-3)抗体(CST公司,美国),磷酸化FoxO1抗体、FoxO1抗体(Abcam公司,英国),细胞计数试剂盒(DoJinDo,日本),Transwell嵌套(带聚碳酸酯膜,尺寸为6.5 mm,孔径为8.0 μm)(Costar 3422),结晶紫染液(武汉谷歌生物),一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物)。

1.2 实验动物

选取无特定病原体级成年雄性SD大鼠(8～10周龄),购于北京华阜康生物科技有限公司。伦理批件号为Fw-2021-0026。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养

hPASMC在平滑肌细胞培养基中培养,在恒温培养箱中以5% CO2、37 ℃和饱和湿度条件下松盖培养。每隔1～2 d更换培养液,当细胞生长到80%铺满时再进行消化和传代。

1.3.2 细胞分组与处理

将hPASMC分为4组:空白对照组、血小板源性生长因子-BB(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)组、PDGF-BB+LY294002组和PDGF-BB+紫杉醇(paclitaxel)组。空白对照组不接受任何额外处理;PDGF-BB组接受20 ng/mL的PDGF-BB处理;PDGF-BB+LY294002组接受20 ng/mL的PDGF-BB处理,并用浓度梯度为10、20、30 μg/mol的LY294002(PI3K抑制剂)处理24 h;PDGF-BB+paclitaxel组接受20 ng/mL的PDGF-BB处理,并用10 μg/mol的paclitaxel(FoxO1激动剂)处理24 h。

1.3.3 动物分组与处理

将12只SD大鼠随机分为4组:空白对照组、MCT组、MCT+LY294002组和MCT+paclitaxel组。空白对照组仅在大鼠颈背部皮下注射生理盐水,其余3组大鼠均在颈背部皮下注射60 mg/kg的MCT,MCT+LY294002组额外接受25 mg的LY294002处理,MCT+paclitaxel组在注射MCT后的第1、7、14和21天额外接受6 mg/kg的paclitaxel处理。

1.3.4 TUNEL染色检测细胞凋亡

将空气干燥的hPASMC样本使用4%多聚甲醛室温固定20～30 min,并用磷酸盐缓冲液洗涤3次。按照TUNEL细胞凋亡试剂盒的说明书进行实验,最后使用倒置显微镜拍照观察,计算TUNEL阳性细胞在总细胞中的比例。

1.3.5 蛋白质印迹法检测细胞Bcl-2和cleaved caspase-3表达水平

消化离心收集各组细胞沉淀并裂解,以4 ℃和12 000 r/min离心5 min收集细胞;使用二喹啉甲酸法对蛋白进行浓度定量。每孔上样100 μg细胞总蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜,使用5%脱脂奶粉溶液封闭2 h,根据蛋白分子量剪下适当的膜带,分别与相应的一抗在4 ℃孵育过夜。带有吐温20的三乙醇胺缓冲盐水溶液洗膜15 min,重复3～4次后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1：1 000),37 ℃孵育2 h,再次洗膜后加入电化学发光试剂,在聚偏氟乙烯膜上滴加工作液,待荧光带明显后,放入天能全自动化学发光分析仪中曝光并拍照。

1.3.6 蛋白质印迹法检测大鼠肺组织Bcl-2、cleaved caspase-3、PI3K、磷酸化Akt、FoxO1及磷酸化FoxO1表达水平

从-80 ℃冰箱中取出大鼠肺组织,剪取部分组织转移到1.5 mL EP管中剪碎。每管加入250 μL裂解液,在冰上裂解45 min。其余步骤同1.3.5。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 PI3K/Akt信号通路对hPASMC凋亡的影响

如图1所示,采用TUNEL法检测各组hPASMC的凋亡情况,以探究PI3K/Akt信号通路对hPASMC凋亡的影响。结果显示,相比于空白对照组,PDGF-BB+LY294002组及PDGF-BB+paclitaxel组凋亡率均显著增加(P<0.01)。

注:control,空白对照组;DAPI,4’,6-二脒基-2-苯基吲哚;**表示P<0.01。图1 TUNEL法测定hPASMC的凋亡水平

2.2 各组hPASMC的Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表达情况

采用蛋白质印迹法检测Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白的表达水平。结果如图2所示,PDGF-BB+LY294002组和PDGF-BB+paclitaxel组hPASMC的Bcl-2蛋白表达水平均显著低于PDGF-BB组(P<0.01),且PDGF-BB+paclitaxel组Bcl-2蛋白表达水平高于PDGF-BB+LY294002组(P<0.01)。相反,相比于PDGF-BB组,PDGF-BB+LY294002组和PDGF-BB+paclitaxel组hPASMC的cleaved caspase-3表达水平更高(P<0.01),且PDGF-BB+paclitaxel组cleaved caspase-3表达水平低于PDGF-BB+LY294002组(P<0.01)。

注:control,空白对照组;GAPDH,甘油醛-3-磷酸脱氢酶;**表示 P<0.01。图2 各组hPASMC的Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表达水平

2.3 各组大鼠肺组织Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表达情况

采用蛋白质印迹法检测大鼠肺组织Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白的表达水平。结果如图3所示,MCT+LY294002组和MCT+paclitaxel组大鼠肺组织的Bcl-2蛋白表达水平均显著低于MCT组(P<0.01),且MCT+paclitaxel组Bcl-2蛋白表达水平高于MCT+LY294002组(P<0.05)。相反,相比于MCT组,MCT+LY294002组和MCT+paclitaxel组的cleaved caspase-3蛋白表达水平更高(P<0.01),且MCT+paclitaxel组cleaved caspase-3蛋白表达水平低于MCT+LY294002组(P<0.01)。

注: control,空白对照组;GAPDH,甘油醛-3-磷酸脱氢酶;**表示P<0.01,*表示P<0.05。图3 各组大鼠肺组织Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表达水平

2.4 各组大鼠PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达情况

采用蛋白质印迹法检测大鼠肺组织PI3K/Akt信号通路相关蛋白。结果如图4所示,MCT+LY294002组和MCT+paclitaxel组大鼠肺组织的FoxO1表达水平均显著高于MCT组(P<0.01),磷酸化FoxO1表达水平均低于MCT组(P<0.01)。MCT+LY294002组和MCT+paclitaxel组大鼠肺组织的磷酸化Akt与Akt表达水平比值均显著低于MCT组(P<0.01)。此外,各组之间PI3K表达水平无显著差异。

注: control,空白对照组;GAPDH,甘油醛-3-磷酸脱氢酶;p-Akt,磷酸化Akt;p-FoxO1,磷酸化FoxO1。**表示P<0.01,*表示P<0.05。图4 各组大鼠肺组织PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达水平

3 讨论

研究数据提示PI3K/Akt/FoxO1信号通路可能在PASMC异常凋亡中发挥作用,研究结果表明PDGF-BB+LY294002组和PDGF-BB+paclitaxel组的hPASMC抗凋亡能力下降。蛋白质印迹法检测结果显示,在PI3K抑制剂作用后,FoxO1的总量增加,磷酸化FoxO1表达水平降低;在FoxO1激动剂作用后,FoxO1表达水平升高,但磷酸化FoxO1表达水平无明显变化。动物实验中也观察到类似效应。本研究的创新之处在于从细胞和动物两个层面首次探究了PI3K/Akt/FoxO1信号通路在肺血管重构过程中的作用及其对凋亡表型的影响。

PH病因复杂多样,病情进展迅速,常导致患者的生活质量下降并增加短期死亡风险[6]。随着对PH发病机制的探究,PASMC异常生物学行为导致的肺动脉重构被认为是该疾病发生与发展的重要环节。既往研究指出了细胞凋亡异常在肺动脉重构中的重要作用。有研究[7]显示,在PH患者的PASMC中,沉默核异质核糖核蛋白A2B1基因会导致携带A2B1基序的信使RNA减少,从而导致细胞增殖和抗凋亡能力下降。同样,Schuoler等[8]发现缺氧诱导的PH小鼠肺组织中水通道蛋白1 的上调进一步增加了hPASMC的凋亡,这种作用与肿瘤抑制基因p53的高表达有关。肺血管重构一旦发生,几乎是不可逆的,是PH治疗中的关键和难点[9]。因此,深入了解肺血管重构机制对于治疗PH具有至关重要的意义。

PI3K/Akt通路广泛存在于细胞中,调节细胞生长、增殖、分化、凋亡和免疫炎症等众多病理生理过程[10]。先前的研究已证实PI3K/Akt信号通路与PH密切相关。在MCT大鼠模型中发现,通过抑制PI3K/Akt信号通路来减轻肺血管重构可能是由于泛素蛋白酶体功能抑制引起的[11]。黄芩苷可通过增加腺苷A2A受体的活性来抑制PI3K/Akt信号通路,从而缓解低氧诱导的PH[12]。饥饿激素可通过激活PI3K/Akt信号通路抵抗低氧诱导的hPASMC凋亡,并参与PH的发生[13]。Li等[14]通过在paclitaxel(FoxO1激动剂)晶体纳米粒子上加载活性蛋白,并使用一层葡糖醛酸包被,成功制备出一种可靶向PASMC的复合制剂——葡萄糖转运蛋白1。这种复合制剂通过抑制细胞周期进程和促进细胞凋亡来逆转肺动脉重构,并改善大鼠的血流动力学参数。在小鼠模型中发现,Maresin 1通过LGR6(糖蛋白激素受体家族成员之一)来抑制Akt和FoxO1磷酸化,从而阻止PASMC增殖并促进细胞凋亡[15]。此外,有研究[16]证明在自体血栓造模下形成的慢性血栓栓塞性PH大鼠模型中,FoxO1和细胞凋亡对其发病机制起重要作用。由于PH患者终末期可能发展为右心衰竭甚至全心衰竭,可推测靶向PI3K/Akt/FoxO1通路可能有助于改善PH患者的预后。

综上所述,本研究认为PI3K/Akt信号通路可能通过下调转录因子FoxO1影响PASMC的凋亡,从而参与PH的发生与发展。未来可探索PI3K/Akt信号通路影响的更多表型与PH发病的关系,以深入挖掘PH的发病机制,寻找潜在的治疗靶点。