基于LC-MS/MS 技术的水蛭配方颗粒中7 种碱基和核苷成分分析方法的建立

姜 俊 程春雷 杨 昊

（山东省食品药品检验研究院（国家药品监督管理局仿制药研究与评价重点实验室），济南，250000）

水蛭为水蛭科动物蚂蝗（WhitmaniapigraWhitman）、水蛭（HirudonipponicaWhitman）或柳叶蚂蝗（WhitmaniaAcranulataWhitman）的干燥全体，具有破血通经、逐瘀消癥等功效，临床上具有很高的药用价值[1].针对水蛭药材，采用液相色谱法对其进行黄嘌呤、尿苷、尿嘧啶、次黄嘌呤中1—4 种碱基及核苷成分的含量测定已有相关文献报道[2−4].碱基是嘌呤和嘧啶的衍生物，是合成核苷、核苷酸和核酸的基本组成单位.核苷是是核酸合成的前体，具有保护神经、抗病毒和抗菌等生物活性.李桃运用多种色谱分离手段从水蛭中提取并分离鉴定出38 个化合物[5]，荆文光等从水蛭甲醇提取物中分离鉴定了18 个化合物[6]，除上述4 种成分外，还包含其他几种成分，如腺苷、腺嘌呤、次黄嘌呤苷（肌苷），但未均建立此类成分的含量测定方法.

水蛭配方颗粒是由水蛭饮片经水加热提取、浓缩、干燥、制粒而成的一种颗粒.目前，水蛭配方颗粒暂未出台相应的国家药品标准，广东、山东、湖南等地公布了水蛭配方颗粒的省级质量标准，这些标准中含量测定项主要涉及抗凝血活性、水蛭胺C、次黄嘌呤的测定.除此之外，未见水蛭配方颗粒中多种碱基和核苷成分同时测定的相关报道.碱基和核苷化合物绝大部分是强极性的小分子，仅依靠传统的疏水作用机制难以进行较好的色谱保留，该类化合物也一直是分析技术的难点.本试验通过多重保留机制的液相色谱-质谱联用技术，建立同时快速测定水蛭配方颗粒中7 种碱基和核苷类成分的含量方法，该方法具有分析快速、准确、灵敏度高的特点，可为水蛭配方颗粒甚至水蛭药材的质量评价提供依据.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

试剂：尿嘧啶、次黄嘌呤、腺苷、腺嘌呤、肌苷对照品（上海源叶生物科技有限公司），黄嘌呤对照品（中国食品药品检定研究院），尿苷对照品（上海安谱实验科技有限公司），纯度均大于98%.水蛭配方颗粒来源于广东一方制药有限公司，每袋1.5 g，每1 g 配方颗粒相当于2 g 药材.

仪器：超高效液相色谱仪Nexera X2 与三重四极杆质谱LCMS-8050 联用系统（岛津，日本）.

1.2 样品的制备

混合标准溶液的制备：精密称取7 种碱基和核苷对照品各适量，除黄嘌呤用20 mmol·L−1氢氧化钠溶解外，其余均采用10%甲醇溶液溶解，最终用10%甲醇溶液配制成系列浓度的混合标准溶液，待上机分析.

样品前处理：取水蛭配方颗粒5 袋，研细，称取约0.1g（精确到0.0001g），加入10%的甲醇溶液100 mL，涡旋混匀1 min，50 ℃超声30 min，4000 r·min−1离心10 min，上清液用0.22 μm 的尼龙滤膜滤过，取续滤液即得.样品的稀释：精密量取制备好的样品续滤液1 mL，用10%甲醇溶液定量稀释至10 mL.

1.3 实验条件

液相色谱条件：色谱柱为Discovery®HS F5-3（150 mm×2.1 mm,3 μm），流动相：A 为0.15%甲酸水溶液，B 为甲醇；流速0.35 mL·min−1，梯度洗脱，0—1min，2%—5%B，1—5 min，5%B—50%B，5—5.5 min，50%B—90%B，5.5—7 min，90%B，7.01—10 min，2%B；柱温40 ℃，进样体积：1 μL.

质谱条件：ESI 正负离子模式同时监测；接口电压：+0.5 kV（正离子），−0.5 KV（负离子）；雾化气流速：氮气3.0 L·min−1；加热气流速：空气15 L·min−1；干燥气流速：氮气5 L·min−1；脱溶剂管温度：150 °C；加热模块温度：300 °C；离子源接口温度：350 °C；扫描模式：多反应监测（MRM）；驻留时间：25 ms；MRM 参数见表1.

表1 7 种碱基和核苷的MRM 参数列表Table 1 MRM parameters for 7 nucleobases and nucleosides

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件的选择

依据待测化合物的溶解性及参考相关文献[4，7]，本实验尝试了使用水、10%甲醇、70%甲醇、0.1%甲酸及10 mmol·L−1氢氧化钠在50 ℃下进行超声提取30 min，考察不同溶剂的提取效率.结果显示：70%甲醇、0.1%甲酸及10 mmol·L−1氢氧化钠提取条件下，肌苷的峰面积偏低，且70%甲醇提取条件下色谱峰会展宽.水和10%甲醇对大部分化合物的提取效率相当，但10%甲醇对腺苷的提取效率要优于水.综合考虑，确定样品溶液的制备方式为10%甲醇50 ℃条件下超声30 min.

2.2 分析条件的优化

本实验曾比较了不同流动相系统对色谱峰及质谱响应的影响，如乙腈－0.02%甲酸和1 mmol·L−1乙酸铵水溶液、乙腈－0.1%甲酸水溶液、甲醇－0.1%甲酸水溶液、甲醇－0.15%甲酸水溶液.最后确定采用甲醇－0.15%甲酸水溶液的流动相体系，该体系下各化合物色谱保留较好且质谱信号较强.

7 种待测碱基和核苷化合物的属于极性较强的化合物，传统反相色谱保留效果欠佳.董萌等尝试用亲水色谱对食品中的碱基、核苷和核苷酸类物质进行色谱保留[8].亲水色谱对强极性化合物保留较好，但要得到较好的峰形和重复性，方法开发的难度往往比普通反相色谱的难度要大.本实验对比了Discovery®HS F5-3、Shim-pack GIST C18 和ShimNex UP C18 色谱柱对分析测试的影响.结果显示Discovery®HS F5-3 色谱柱对待测化合物的保留最好，且质谱响应信号相对更高.Discovery®HS F5-3 是一款在硅胶基质上键合了五氟苯基的色谱柱，提供了疏水作用、氢键作用、离子作用等多重保留机制，对强极性化合物的保留和异构体的分离优于常规C18 柱.

2.3 精密度试验

将10 ng·mL−1的混合对照品溶液连续进样6次，尿苷、肌苷、腺苷、次黄嘌呤、腺嘌呤、尿嘧啶和黄嘌呤7 种化合物测得峰面积的RSD 分别为4.50%、5.83%、1.84%、3.35%、4.27%、2.08%、3.54%，表明精密度良好.

2.4 线性范围和灵敏度

取系列浓度的混合标准溶液上机测定，以对照品浓度为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y）绘制校准曲线，得到7 种碱基和核苷的线性方程、判定系数.以各化合物信噪比（S/N）约为3时计算对应的浓度为检出限（LOD），各对照品信噪比（S/N）约为10 时对应的浓度为定量限（LOQ），结果如表2 所示.由表2 可知，7 种碱基和核苷在相应的浓度范围内具有良好的线性关系，判定系数（R2）≥0.996，检出限在0.13—1.18 μg·g−1范围内，定量限在0.43—3.94 μg·g−1范围内，该方法灵敏度较高.

表2 7种碱基和核苷的线性范围及灵敏度Table 2 Linear range and sensitivity of 7 nucleobases and nucleosides

2.5 加样回收率试验

取“1.3”项下样品溶液上机测定，以外标法计算7 种碱基和核苷的含量.尿苷、肌苷、腺苷、次黄嘌呤、腺嘌呤、尿嘧啶和黄嘌呤的含量分别为41.42、7.11、1.24、314.87、4.89、55.83、53.95 μg·g−1.本品中尿苷、次黄嘌呤、尿嘧啶和黄嘌呤的含量相对较高，肌苷、腺苷和腺嘌呤有检出，但含量较低.另精密称取已测知含量的水蛭配方颗粒约0.1g，精密加入适量的对照品储备液，按“1.3”项方法制成加样回收样品溶液，平行制备6 份.进行次黄嘌呤回收率测试时，将以上加样回收样品溶液稀释10 倍上机进行测定，外标法计算平均回收率，结果见表3.7 种碱基和核苷的平均回收率在87.09%—105.81%之间，RSD%在1.35%—4.70%之间，表明方法的准确性高.

表3 7种碱基和核苷的加样回收率（n=6）Table 3 The recovery data of 7 nucleobases and nucleosides

续表3

2.6 残留实验

高浓度混合标准溶液（1000 ng·mL−1）分析完成后，进样10%甲醇试剂空白，考察残留情况.结果表明，7 种碱基和核苷化合物检测通道中均无明显目标化合物干扰.

3 结论

本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪Nexera X2 和三重四极杆质谱仪LCMS-8050 联用测定水蛭配方颗粒中7 种碱基和核苷成分的分析方法.该方法分析速度快，重复性好，灵敏度和准确度较高，适合水蛭配方颗粒中碱基和核苷类化合物的快速定量检测，可为水蛭配方颗粒的质量评价提供参考.