如何快速高效分离李斯特菌属

贺炎娜，李 丹，张云鲜，王 丹，王海芸，崔永静

蒙牛乳业（焦作）有限公司，河南 焦作 454000

单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）常出现于土壤中，是以死亡的和正在腐烂的有机物为食的腐生菌，能产生溶血素，引起人类发烧、腹泻、头痛、发冷、恶心、肌痛等症状，也是肉制品、乳制品、鱼类、冷藏类食品中的一种污染物，感染后主要表现为败血症、脑膜炎，对人类健康危害较大。

对于单增李斯特氏菌，检验技术机构采用国家标准法作为基础方法进行检验。如何有效地鉴别单核细胞增生李斯特菌，则需要与其他相似菌进行对比试验，在试验过程中记录生理生化试验结果的相同点及不同点，从而准确快速地分辨单核细胞增生李斯特菌。

从2021 年开始，本实验室陆续购入李斯特菌属的标准菌株：英诺克李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌。依据GB 4789.30-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》[1]，人为地将李斯特菌属的标准菌株添加至样品中，在连续的试验中观察对应标准菌株的菌落形态、生化及溶血试验，从而找出不同菌株的差异性，提升实验人员的综合水平。

1 材料与方法

1.1 菌株与培养基

标准菌株：伊氏李斯特氏菌ATCC19119[美国菌种保藏中心（American type culture collection，ATCC）]、斯氏李斯特氏菌CICC35967、英诺克李斯特氏菌CICC10417、单增李斯特氏菌CICC21635[中国工业微生物菌种保藏管理中心（China center of industrial culture collection，CICC）]。

含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆肉汤（Trypticase Soy-Yeast Extract Agar，TSA-YE）、BHI 肉汤（Brain Heart Infusion Broth）、血琼脂平板、PALCAM 琼脂基础（PALCAM Agar Base）、李斯特氏菌显色培养基（Listeria Chiomogenic Medium）、半固体培养基（Motility Test Medium（Semisolid））、单增李斯特氏菌干制生化鉴定试剂盒（Listeria Monocytogenes Dehydration Biochemical Identification Kit）、3%过氧化氢溶液、PALCAM 选择性添加剂、革兰氏染色液（GRAM STAIN SETS）试剂盒。以上培养基均来源于北京陆桥技术股份有限公司。

1.2 仪器

BSP-250 生化培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、SPX-250B 生化培养箱（上海福玛实验设备有限公司）、BSC-1300ⅡA2 生物安全柜（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、培养皿（玻璃培养皿或一次性培养皿）、18 mm×180 mm 试管、接种针及对应的灭菌装置（如酒精灯或红外灭菌器）、Primo Star 显微镜（卡尔蔡司股份公司）、VITEK 2 COMPACT 微生物鉴定仪（法国生物梅里埃公司）。

1.3 实验方法

参照GB 4789.30-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》方法。

1.3.1 菌种的活化

标准菌株需从专业从事微生物菌种保藏管理的机构处获得，严格按照标准菌株附带的操作流程活化。实验室按照相应的操作流程将菌株活化后，将其保存在营养肉汤中，同时添加10%～15%的甘油作为冷冻保护培养基[2]，获得标准储备菌株，并将其贮存在（-20±2）℃的专用冰柜中。

1.3.2 菌种的复活

将上述活化后的菌株取出，分别放置在营养肉汤或BHI 肉汤（Brain Heart Infusion Broth）中（36±1）℃培养18～24 h。

1.3.3 划线分离与纯化

使用李斯特氏菌显色培养基（Listeria Chiomogenic Medium）和PALCAM 琼脂基础（PALCAM Agar Base）划线培养后的营养肉汤或BHI 肉汤，于（36±1）℃培养（24±2）h 后，观察菌落形态。同时将上述平板上的菌落划线纯化至TSA-YE 平板上，进行后续的鉴定实验。

1.3.4 鉴定

①染色镜检；②动力试验；③生化鉴定：用3%过氧化氢溶液及干制生化试剂盒鉴定，生化试剂盒包含木糖、鼠李糖、MR-VP、葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、七叶苷；④溶血试验：穿刺接种；⑤使用VITEK 2 COMPACT 微生物鉴定仪进行鉴定[3]。

2 结果与分析

2.1 分离与纯化

不同菌株在相应培养基上的菌落形态见表1。由于试验过程中使用非选择性增菌培养基TSAYE，故在TSA-YE 生长的菌株均为乳白色，从菌落形态上无法进行区分。

表1 各菌株在不同培养基上的生长情况

2.2 鉴定

2.2.1 染色镜检

挑取TSA-YE 平板上的菌落进行染色镜检见图1。镜检结果表示，四种标准菌株均为革兰氏阳性短杆菌。

图1 显微镜下的形态

2.2.2 动力试验

使用接种针将TSA-YE 平板上的菌落穿刺至半固体培养基中，于（30±1）℃培养48 h～5 d。半固体生长状态见图2。

图2 半固体动力培养基中的形态

2.2.3 生化鉴定

生化鉴定结果见表2，MR-VP、葡萄糖、麦芽糖、七叶苷、过氧化氢酶试验无法区分斯氏李斯特氏菌CICC35967、英诺克李斯特氏菌CICC10417、伊氏李斯特氏菌ATCC19119、单增李斯特氏菌CICC21635四种菌株。伊氏李斯特氏菌ATCC19119、斯氏李斯特氏菌CICC35967 鼠李糖和木糖的结果分别为（-）、（+），英诺克李斯特氏菌CICC10417、单增李斯特氏菌CICC21635 鼠李糖和木糖的结果分别为（+）、（-），这两个试验可进行有效区分。

表2 各菌株的生化鉴定结果

2.2.4 溶血试验

单增李斯特氏菌产生狭窄、清晰、明亮的溶血圈，斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生弱的透明溶血圈，英诺克李斯特氏菌无溶血圈，伊氏李斯特氏菌产生宽的、轮廓清晰的β-溶血区域。

2.2.5 VITEK 2 COMPACT 微生物鉴定仪鉴定

利用VITEK 2 Compact 全自动微生物分析系统对伊氏李斯特氏菌ATCC19119、斯氏李斯特氏菌CICC35967、英诺克李斯特氏菌CICC10417、单增李斯特氏菌CICC21635 四种菌株进行鉴定，磷脂酰磷脂酶C（PIPLC）、D-木糖（dXYL）、α-葡萄糖苷酶（AGLU）、α-甘露糖苷酶（AMAN）、酪氨酸芳胺酶（TyrA）、多粘菌素B 耐受（POLYB）、乳糖（LAC）、新生霉素耐受（NOVO）、6.5%NaCl 生长（NC6.5）、D-海藻糖（dTRE）等10 项检测结果不一致，其余33 项生化鉴定结果一致，结果分别判定为伊氏李斯特氏菌（93%概率）为非常好的鉴定，斯氏李斯特氏菌（97%概率）为极好的鉴定，英诺克李斯特氏菌（99%概率）为极好的鉴定，单核细胞增生李斯特氏菌（99%概率）为极好的鉴定。

3 结论

本研究表明，菌株的关键特性在试验中可快速、高效的区分与分离，同时木糖和鼠李糖试验可初步筛选区分4 株标准菌株。未来可以通过科学技术，将木糖和鼠李糖加入鉴别培养基中，在划线分离步骤中通过颜色信息进行区分，缩短试验过程，提高检测效率。