细菌外膜囊泡在疫苗领域的应用研究进展

吴娅芳，胡展驰，王 毅，权春善

大连民族大学生命科学学院，辽宁 大连 116600

1963 年，研究人员通过电子显微镜首次在细菌的细胞壁处发现了外膜囊泡（outer membrane vesicles，OMVs）[1-2]，因对其组成、结构和功能均不清楚，固认为其是细胞凋亡所产生的细胞碎片[3]。1987年，Johnstone 等[4]发现羊网状细胞能够分泌纳米级囊泡，并将其命名为外泌体（exosome）。此后，越来越多文献开始报道革兰氏阴性菌可分泌类似外泌体的囊泡[5]，功能与细胞外泌体相似，被称为细菌外膜囊泡。1999 年，Beveridge 等[6]对铜绿假单胞菌OMVs 的系列研究最早揭示了OMVs 的天然杀菌活性及其成为抗菌药物载体的潜力。至此，对OMVs 的研究开始引起了人们的广泛重视。起初人们对OMVs 的研究主要集中于对其功能的探索，但随着对OMVs 生物合成、组成分析的深入研究，OMVs 的结构、生物学作用和免疫作用逐渐清晰了起来。随着研究的不断深入，OMVs 已被认为是疫苗研发过程中潜在的疫苗抗原候选物之一。本文对OMVs 的结构研究及其在疫苗相关领域的应用进展进行综述，以期为OMVs 在疫苗开发领域、药物递送系统，乃至抗菌剂、靶向治疗肿瘤等医学领域的应用研究提供参考和理论支撑。

1 细菌外膜囊泡

1.1 合成机制

OMVs 起初被认为是细菌裂解的副产物，但随后OMVs 被证实是由原核微生物分泌产生的，有关其产生的具体机制开始变得说法不一[7]。目前被大部分学者普遍接受的观点是，OMVs 的形成及其携带的物质并不是随细菌死亡而随机产生的，而是存在一种精细有序的调控过程[8]。当前研究认为OMVs的生物合成调控机制主要包括三种，即压力聚集、膜交联调节、脂类富集，如图1 所示。

图1 细菌外膜囊泡的合成机制示意图

细胞周质中存在大量肽聚糖片段和错误折叠的蛋白质以及一些促进膜囊泡等物质生成的异常组分，这些异常组分的局部堆积和富集会给细胞膜造成压力，降低包膜的完整性，使肽聚糖层由外膜层分离，向外突出形成OMVs[9-10]。如幽门螺杆菌[11]和波伊德志贺菌[12]就是通过这种调节机制产生OMVs 的。

革兰阴性菌的膜结构分为内膜层、肽聚糖层（PG）和外膜层3 层[13]。周质腔中的脂蛋白（lipoprotein，LPP）可以通过Lpp-PG 的方式连接细菌的外膜层和肽聚糖层，使其被分解或破坏，导致外膜层和肽聚糖层两层之间的连接变得不稳定，最终导致外膜凸起形成球状囊泡，引发OMVs 的产生和释放[1]。与之相反，如果缺少mDAP-mDAP 肽连接，就会引起Lpp-PG 连接的上升，导致OMVs 的产量下降[9]。如大肠杆菌和沙门氏菌在缺少ompA 的情况下，OMVs 的产量会显著上升[14-16]。

外膜中富集有大量脂质，这些脂质会影响膜的曲率与流动性，因此脂质可能会在OMVs 的分泌形成过程发挥关键作用。有研究指出，当在外膜中加入修饰过的脂多糖（lipopolysac-charide，LPS）或磷脂等成分后，外膜的曲率会发生变化，从而诱导更多OMVs 的形成与释放[1，17]。此外，温度变化也会影响OMVs 的产量。温度的调节会影响膜上脂质的流动性，但温度对不同种属菌类的影响也不同。在大肠杆菌中，随着温度升高，膜上脂类的流动性会不断增强，OMVs 的产量会增加；而在铜绿假单胞杆菌中，温度升高12 ℃或14 ℃都不会改变OMVs 的产量[18]。

1.2 结构和组成

OMVs 是一种由双层膜包裹的球状纳米颗粒，直径范围为20～250 nm。但这种结构并不是绝对的。有研究发现，除了OMVs 双层膜球形结构，研究人员在某些古细菌（Archaebacteria）上还发现了管型、细长型等其他结构类型[19]。OMVs 主要由细胞外膜的成分组成，包括丰富的外膜蛋白、脂多糖、肽聚糖以及一系列与宿主组织黏附和侵袭有关的毒力因子，同时也包含一些细胞内成分，例如DNA，RNA 和酶等，这些组成成分同样决定了其对细菌多种生物过程的影响能力，包括生物膜的形成、DNA 转移、细胞代谢物和毒力因子的运输等。随着蛋白质组学技术的进步，在OMVs 中已经鉴定出了很多不同功能类别的蛋白质[20]。如参与细菌对宿主黏附和侵染的OM蛋白（OmpA、OmpC 和OmpF）和周质蛋白（AcrA、碱性磷酸酶）。

脂质是OMVs 的重要结构成分。Horstman 等[21]报道大肠埃希杆菌OMVs 以甘油磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和心磷脂为主要脂质，这些脂质与OMVs 的曲度有关。有研究报道OMVs 中亦存在一些不属于细菌外膜成分的脂质[22]，还有些学者猜测OMVs 所包含的核酸是细菌裂解残留物偶然渗入的，也有学者认为其生物发生过程并非偶然现象[23]。

1.3 生物学作用

几乎所有的革兰氏阴性菌都会产生OMVs，可见OMVs 的存在对细菌的意义之大。目前普遍认为OMVs 对革兰氏阴性菌的生物学作用主要包括信息交流、营养摄取、防御作用和环境压力耐受这四个方面。OMVs 装载了多种来自亲本细菌的生物分子和外源性生物分子，这些生物分子会随OMVs 的传递进行细胞间的信息交流。如铜绿假单胞菌外膜囊泡包裹喹诺酮信号（PQS）分子，喹诺酮信号分子以OMVs 为载体，在细菌群体内进行信息传递。

OMVs 所含的组分十分复杂，包含许多可以降解生物大分子的酶类物质。因此，当细菌所生活的环境中存在某些大分子类物质时，OMVs 便可以将其降解并使其被细菌吸收利用。此外，OMVs 还可以与细菌细胞膜融合，有助于细菌获取营养物质。如百日咳杆菌外膜囊泡可充当铁输送系统，在铁限制的条件下可以补充百日咳杆菌的生长缺陷[24]。

病原体定植于宿主组织的恶劣环境中时可能会遇到多种压力源，病原体为了对抗压力和生存，就会建立多种防御机制，其中之一就是释放OMVs。OMVs 在此过程中会充当诱饵，保护细菌细胞免受抗生素、抗菌肽和噬菌体等的伤害。如在对鲍氏不动杆菌（Acinetobacter baumannii）的研究中发现，β-内酰胺酶基因blaOXA-24 为阳性的OMVs 可以将其传递给阴性菌株使其获得耐药基因[2，25]。

OMVs 的形成理论中有这样一种观点，即释放出来的OMVs 可以携带菌体本身合成的一些错误折叠的蛋白或过量的肽聚糖片段，是细菌处理“垃圾”的一种方式。细菌也可以通过释放OMVs 将这些垃圾释放出去，从而减轻其环境压力。如用环氧沙星处理铜绿假单胞菌，该细菌便会通过释放OMVs 来抵抗不良生存环境[1]。

2 细菌外膜囊泡在疫苗研发中的应用

2.1 作为候选疫苗

OMVs 疫苗可以诱导机体产生高抗体，使其具有更高的有效性。研究表明，OMVs 中含有众多抗原蛋白且不具有复制能力，接种OMVs 疫苗可以诱导机体产生多种具有杀菌活性的抗体，且其在动物模型中具有免疫保护功能[26]。这一特质使OMVs 成为了疫苗研发环节的优质候选抗原。

OMVs 疫苗作为一种极具潜力的疫苗种类，具有成本低、可以诱导有效的保护性免疫应答等优点。2013 年，商品名为Bexsero 的针对引发流行性脑脊髓膜炎而研发生产的B 型脑膜炎耐瑟菌OMVs 疫苗在欧洲成功获批上市，并在古巴、智利、挪威和新西兰等地投入使用[27]。除了针对脑膜炎球菌的OMVs疫苗，结核分枝杆菌[28]、金黄色葡萄球菌[29]等其他细菌的OMVs 疫苗也正处于研发阶段。此外，用于治疗莱姆病的脑膜炎奈瑟菌OMVs 疫苗[30]，治疗产肠毒素大肠杆菌的霍乱弧菌OMVs 疫苗[31]，治疗肺炎的鼠伤寒沙门菌OMVs 疫苗[32]以及治疗肺结核的异源OMVs 疫苗[33]等也正处于研究过程中。这些疫苗的研发不仅说明OMVs 在B 群脑膜炎球菌疫苗领域的研究已经得到了广泛认可，更证明了OMVs 作为候选抗原的优势和发展前景[34]。

除此之外，有些菌的OMVs 疫苗还可以用来缓解患者的炎症。如百日咳菌的OMVs 疫苗在降低患者炎性反应的同时，也具有与其他疫苗相同的保护作用[2]。

2.2 作为佐剂

疫苗佐剂（adjuvant）能够非特异性地改变或增强机体对抗原的特异性免疫应答，诱发机体产生长期、高效的特异性免疫反应，增强机体的保护能力，与此同时还可减少免疫物质的用量，降低疫苗的生产成本。目前关于佐剂的研究主要集中于两方面，一是受体激活剂，二是疫苗的递送系统[35-36]。OMVs 表面的脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）是Toll 样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）的典型激活剂。激活这些信号通路不仅可以诱导细胞释放大量可以介导多项免疫反应的促炎性细胞因子，还可以促进抗原递呈细胞成熟并用于激活适应性免疫[1]。由此可见，OMVs 表面的LPS 可以作为很好的免疫激活剂，且具有很大的研究价值。

将OMVs 用作佐剂的研究可以追溯到二十世纪末[37]。在HIV 疫苗的研究过程中，OMVs 佐剂被证明可以诱导T 细胞反应[38]。Nagaputra 等[39]研究表明，脂多糖（LPS）修饰糖型（LgtB-LpxL1）与非修饰糖型Lpxl1 血清组脑膜炎球菌H44/76 天然外膜囊泡（nOMVs）对重组脑膜炎球菌蛋白、破伤风类毒素或脑膜炎球菌C 血清群荚膜多糖等具有佐剂作用，能够取得与传统佐剂相同甚至优于传统佐剂的效果。

2.3 作为药物递送系统

OMVs 相对稳定，可以保护内部物质免受细胞内核酸酶与蛋白质水解酶降解[21，40-41]。有研究表明，OMVs 可在4 ℃下长期储存，甚至在短暂的高温作用下仍能保持酶活性和抗原性[42]。而且，其不会因长距离运输而降解，由此可解决疫苗长距离运输抗原活性低的问题。有研究表明，利用基因工程技术可使OMVs 负载的抗原不仅可以暴露于OMVs 表面，也可以负载于OMVs 的腔体中[43-44]。上述技术优势一方面可以保护OMVs 内的抗原，另一方面还可以于OMVs 表面在其他外源抗原的帮助下将内部抗原靶向递呈于抗原递呈细胞中。

目前OMVs 领域一个新的研究方向是将异源抗原表达于OMVs 表面从而构建新疫苗。目前，已有学者通过基因工程改造技术将甲型流感病毒的基质蛋白M2 异源表达于大肠杆菌的外显子中，并成功表达出了包含此蛋白的OMVs，通过动物实验进行临床检验，证明此种方式制得的疫苗可以抵抗同型流感病毒的攻击[45]。OMVs 疫苗相较其他疫苗具有更高的可修饰性，可通过基因工程等手段加强疫苗的靶向性，由此可见，OMVs 疫苗拥有更广泛的研究方向。

3 细菌外膜囊泡的其他领域的应用

3.1 作抗菌剂的研究

细菌需要附着于宿主细胞并定植在相关组织中，然后再扩散到其他组织，才能感染机体[46]。目前，已经出现了一种通过使用抗菌黏附剂来抑制细菌的黏附作用从而治疗感染的新型抗菌治疗方法，其被称为抗菌黏附疗法[47]。抗菌黏附剂主要通过破坏细菌上的黏附素或竞争性，与宿主细胞结合来抑制细菌与宿主细胞结合[48]。

OMVs 中含有较多细菌黏附素，这种性质决定了OMVs 可以竞争性地与宿主细胞结合，起到抗菌黏附剂的作用。Zhang 等[49]通过带有黏附素的幽门杆菌OMVs 包裹纳米颗粒，构建了一种抗菌黏附剂纳米平台。其实验结果显示，该OMVs 纳米平台能够降低幽门杆菌对宿主细胞的黏附性，同时，通过对小鼠胃组织幽门杆菌的研究也证实了该OMVs 可以削弱细菌的黏附作用。

3.2 在医疗用药方面的应用

OMVs 对细菌的一个重要作用就在于可以为其提供适宜的生存环境。细菌在产生应激反应对会产生更多OMVs，而抗生素就是刺激细菌产生OMVs的因素之一。肠出血性大肠埃希菌分泌的志贺毒素2a 会引起溶血性尿毒综合征。研究发现[50]，磷霉素、环丙沙星等抗生素会刺激出血性大肠埃希菌O104:H4 和O157∶H7 产生OMVs，其中，环丙沙星还会使OMVs 中的志贺毒素含量增加。因此，治疗此类患者时不应使用上述抗生素。同时，细菌遇到抗生素发生应激反应产生OMVs 的性质也可以应用于OMVs 的制备过程中。

3.3 抗肿瘤应用研究

OMVs 作为一种不具有分裂能力、稳定度较高的纳米粒子，包含母体细菌的主要免疫原性蛋白质，可以有效激活免疫系统，特异性杀伤异常的肿瘤细胞，同时还可以高效转运药物。以上性质使OMVs 成为了一种治疗肿瘤的新型手段[26]。

正常情况下，人体的免疫系统可以识别并清除肿瘤细胞，但肿瘤细胞可以通过破坏抗肿瘤-免疫循环，实现“免疫逃逸”，得以不受控制地生长。肿瘤免疫治疗主要通过重新激活机体的抗肿瘤-免疫循环来杀死肿瘤细胞[51-52]。Li 等[53]通过融合大肠杆菌OMVs 和黑色素瘤细胞膜（TCMs）即BTs，整合PLGA 到BTs 中作为核心形成BTs@PLGA，开发有效的囊泡疫苗。BTs@PLGA 的治疗显著增强了DC靶向、DC 成熟、肿瘤抗原呈递以及抗原特异性T 细胞的反应，具有良好的抗肿瘤治疗效果。

4 总结与展望

鉴于上述OMVs 疫苗区别于其他疫苗的优点，以及已开发的OMVs 疫苗平台，我们可以看出OMVs 疫苗应用领域广泛且拥有良好的发展前景。OMVs 疫苗的应用研究已成为国内外研究的热点，但是，目前有关OMVs 疫苗的研究和应用主要是针对细菌引起的相关疾病，而针对病毒研发的OMVs疫苗却少之又少。

2019 年末新型冠状病毒肺炎肆虐中国，开发拥有长效免疫能力且能够应对不同变种新型冠状病毒的疫苗是预防疾病、增强机体抵抗力的一种高效方法。目前市场上常见的针对新冠病毒的疫苗主要分为三种，一是新冠灭活疫苗，二是新冠腺病毒载体疫苗，三是新冠重组蛋白疫苗。虽然这三种病毒均对抑制新冠肺炎具有一定的有效性，但都各有缺点，并且在注入人体后均会引发一系列不良反应，而有研究证明百日咳菌的OMVs 疫苗在使机体产生的炎症反应更少的情况下，可以起到相同的保护作用[2]，由此可推断新冠病毒的OMVs 疫苗也可能拥有相同的防护效果。因此，研制针对新冠病毒的OMVs 疫苗具有重要的研究价值和应用前景。