基于UPLC 多指标含量测定和指纹图谱的不同种质金银花药材质量评价研究

王 淑，张翠翠，郭凤丹，孙新茹，李圣波，林慧彬*，管仁伟*

1. 山东省中医药研究院，山东 济南 250014

2. 山东亚特生态技术股份有限公司，山东 临沂 276017

金银花为忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb. 的干燥花蕾或带初开的花，属临床常用大宗中药材[1]，具有清热解毒、疏散风热的功效，可用于治疗痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温病发热等症。金银花原植物分布广泛，在长期的驯化栽培过程中，形成许多不同类型的地方品种，而且引进一些国外品种，其外观性状、活性成分等方面存在差异[2]，是影响其品质的重要因素。与性状鉴别相比，活性成分分析能更客观、精准的揭示种间、种内的差异，近年来在金银花质量评价研究中得到广泛应用[3]。本实验采用超高效液相色谱仪，建立一种指纹图谱和含量测定分析方法，对41 批不同种质不同发育期金银花进行指纹图谱分析、化学模式识别分析及含量测定，从化学成分方面系统整体研究不同种质金银花之间的质量差异，为金银花药材质量评价提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1290 型超高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；ME204E 型万分之一分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；XS205DU 型十万分之一分析天平（梅特勒-托利多国际有限公司）；JM-30D-40 型液晶单频超声波清洗仪（深圳市洁盟清洗设备有限公司）；WGH201 型纯水机（日本YAMATO 科学株式会社）。

1.2 材料

新绿原酸（批号D23GB172337）、异绿原酸A（ 批号 P11D11L134209）、 隐绿原酸（批号M06GB147634）、马钱苷（批号20120427）、咖啡酸（ 批 号 M27GB143417 ）、 芦 丁 （ 批 号T20N11Z131674）、当药苷（批号P31M7F12286）、木犀草苷（批号Y19A8H34394），以上对照品均购自上海源叶生物科技有限公司；断氧化马钱子苷（批号ST20380110）、异绿原酸B（批号ST06590120）、异绿原酸C（批号ST06600120），质量分数均大于98%，以上对照品均购自上海诗丹德标准技术服务有限公司；绿原酸（质量分数99.3%，批号110753-201716），对照品购自中国食品药品检定研究院。

41 批不同种质金银花药材于2022 年5 月27日采自山东亚特药用植物生态园，经山东省中医药研究院林慧彬研究员鉴定为忍冬L.japonicaThunb.。对10 个种质金银花不同发育期（三青期、二白期、大白期、银花期、金花期）药材进行采集，共采集到41 个样品，烘干备用。药材来源信息见表1。

表1 金银花样品来源Table 1 Source of Lonicerae Japonicae Flos samples

甲醇、乙腈（product of DNK，美国，色谱纯）；磷酸（天津市科密欧化学试剂有限公司，色谱纯）；超纯水（实验室自制）。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

取金银花粉末（过四号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇50 mL，称定质量，超声处理（功率512 W、频率40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用75%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，经0.22 μm 微孔滤膜，即得。

2.2 对照品溶液的制备

取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷、芦丁、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A 和异绿原酸C 对照品适量，精密称定，置量瓶中，加75%甲醇制成含0.92、2.08、1.46、1.44、2.14、1.12、2.04、2.06、0.09、0.88、0.96、2.64 mg/mL 的对照品储备液。取以上12 种对照品储备液适量，加75%甲醇配制成新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷、芦丁、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A 和异绿原酸C 分别为29.01、211.22、14.16、30.74、37.63、60.02、82.55、49.16、24.90、25.19、66.87、36.56 μg/mL 的混合对照品溶液。

2.3 色谱条件

Agilent 1290 型超高效液相色谱仪；Thermo AccucoreTMC18色谱柱（100 mm×4.6 mm，2.6 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），二元梯度洗脱程序：0～4 min，8% A；4～6 min，8%～10%A；6～7 min，10% A；7～10 min，10%～14% A；10～27 min，14%～15% A；27～35 min，15%～25%A；35～40 min，25% A；柱温30 ℃；体积流量0.3 mL/min；进样量1 μL；检测波长0～13.5 min，324 nm；13.5～18 min，238 nm；18～27 min，354 nm；27～40 min，324 nm。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取混合对照品溶液，按“2.3”项下建立的色谱条件进行测定，连续进样6 次，记录12 个对照品色谱峰的峰面积。峰面积的RSD 为0.06%～2.03%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验 取金银花药材粉末，按照“2.1”项下方法制备6 份供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行测定，计算12 个对照品的质量分数。结果显示，各对照品质量分数的RSD 为0.69%～3.69%。

2.4.3 稳定性试验 取金银花供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件分别于0、2、4、8、12、24 h 进样测定，记录12 个对照品色谱峰的峰面积。各对照品色谱峰峰面积RSD 为0.31%～1.72%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.4.4 线性关系考察 精密吸取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷、芦丁、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A 和异绿原酸C 储备液适量，分别用75%甲醇配制成6 个质量浓度系列的对照品溶液，按“2.3”项下色谱条件测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，并进行线性回归，得12 种成分的回归方程与线性范围，见表2。

表2 线性关系考察结果Table 2 Linear relationship results

2.4.5 加样回收率试验 精密称取已测定12 种成分含量的金银花样品6 份，每份约0.25 g，按对照品与样品含量比为1∶1 的比例加入新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷、芦丁、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 对照品，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷、芦丁、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A 和异绿原酸C的加样回收率分别为101.8%、100.2%、101.7%、101.5%、100.8%、96.36%、98.99%、97.60%、98.79%、103.1%、98.12%、99.85%，RSD 值分别为2.83%、2.44%、2.34%、1.29%、2.13%、2.07%、2.54%、2.69%、2.49%、2.78%、1.86%、2.62%。

2.5 样品含量测定

取41 批不同种质金银花药材粉末，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样测定，测定结果见表3。由表可知，41 批不同种质金银花的不同发育期药材中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷、芦丁、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 12 种化学成分的含量变化范围分别为0.35～1.20 mg/g、8.60～50.21 mg/g、0.16～1.01 mg/g、0.16～0.31 mg/g、0.50～2.58 mg/g、0.13～3.19 mg/g、1.4～45.57 mg/g、0.23～1.79 mg/g、0.18～1.23 mg/g、0.16～0.88 mg/g、3.78～30.62 mg/g、0.29～4.97 mg/g。表明12种化学成分的含量与不同种质金银花药材密切相关，随金银花不同发育期而明显变化，具有显著差异，见图1。

图1 不同种质金银花不同发育期药材的12 种化学成分含量测定折线图Fig.1 Line chart for determination of 12 chemical components of different germplasm of Lonicerae Japonicae Flos at different development stages

表3 不同种质金银花不同发育期药材的12 种化学成分含量测定Table 3 Determination of 12 chemical components in different germplasm of Lonicerae Japonicae Flos at different development stages

2.6 指纹图谱的构建及相似度分析

2.6.1 方法学考察 精密度试验、重复性试验、稳定性试验方法参考“2.4.1”“2.4.2”“2.4.3”项。精密度试验各对照品色谱相对峰面积RSD 在0.61%～2.77%，重复性试验相对峰面积RSD 为0.46%～2.81%，稳定性试验相对峰面积RSD 为0.31%～1.72%，均符合要求。

2.6.2 指纹图谱的构建 取41 批不同种质金银花的不同发育期药材粉末，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样测定，记录UPLC 色谱图，并导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）》软件，以S1 样品色谱图为参照图谱，对41 批样品色谱峰进行多点校正和全峰匹配，设定时间窗宽度为0.1 min，以平均数法生成对照图谱，41 批不同种质金银花的不同发育期药材指纹图谱共有模式见图2。

图2 不同种质金银花药材指纹图谱 (A) 和共有模式 (B)Fig.2 Fingerprint of different germplasm (A) and common pattern (B) of Lonicerae Japonicae Flos

指纹图谱中共标定共有峰11 个，其中指认化学成分9 个，分别为新绿原酸（1 号峰）、绿原酸（2号峰）、隐绿原酸（3 号峰）、马钱苷（4 号峰）、断氧化马钱子苷（5 号峰）、木犀草苷（7 号峰）、异绿原酸B（8 号峰）、异绿原酸A（9 号峰）、异绿原酸C（11 号峰）。

2.6.3 指纹图谱的相似度评价 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件，计算金银花指纹图谱的相似度，结果见表4。结果显示，41 批不同种质不同发育期金银花的相似度在0.723～0.996，除S23 的相似度为0.723 以外，其余金银花相似度均大于0.91。结果表明相同种质金银花不同发育期的药材之间化学成分存在差异；除极少数发育期外，不同种质金银花相同发育期的药材存在一定差异，但质量相对稳定。

表4 不同种质金银花不同发育期药材指纹图谱相似度评价Table 4 Similarity of fingerprint of different germplasm of Lonicerae Japonicae Flos at different development stages

2.7 化学模式识别研究

2.7.1 主成分分析（principal component analysis，PCA） PCA 是一种无监督化学模式识别，可使数据矩阵简化，降低维数，通过少数几个主成分揭示数据结构特征[4]。由于41 批不同种质不同发育期金银花的样品中超过一半未检测到咖啡酸，因此将41批样品中除咖啡酸外的11 个化学成分峰面积数据进行PCA，结果见图3-A，亚特8 号美国忍冬、亚特4 号意大利忍冬与其他样品显著区分，表明不同种质金银花之间存在一定差异。不同发育期金银花样品也相互区分明显，表明不同发育期金银花药材之间质量存在差异。根据41 批不同种质金银花PCA分析结果、指纹图谱分析结果、预实验结果及样品来源特点，从41 批不同种质金银花药材中筛选区别较大且比较有研究意义的6 批金银花亚特2 号、亚特立本、亚特4 号、亚特8 号、鸡爪花、北花1号样品进一步进行重点分析。将6 批不同种质不同发育期金银花的11 个化学成分峰面积数据进行PCA 分析，结果见图3-B，6 批不同种质金银花样品可以被区分。

图3 PCA 得分图Fig.3 PCA Score chart

2.7.2 正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLSDA） 进一步采用OPLS-DA 对6 批不同种质金银花样品进行分析。将6 批不同种质金银花各发育期11 种化学成分含量进行OPLS-DA，相同种质金银花样品作为1 组，筛选不同种质金银花药材的差异标志物。结果如图4-A 所示，OPLS-DA 得分图表明各种质被区分，并对模型进行验证，设定检验数为200 次，如图4-B 所示，左边的R2点和Q2点均低于右边，Q2点的回归线与纵轴相交于原点以下，表明未产生过分拟合，模型可靠。如图4-C 所示，根据VIP 值＞1 筛选出4 种差异标志物，分别为断氧化马钱子苷、新绿原酸、马钱苷、隐绿原酸。可以认为这4 种差异标志物是不同种质金银花质量评价的重要指标性成分。另外，木犀草苷、芦丁、当药苷的VIP 值分别为0.999、0.991、0.988，均接近于1，可作为不同种质金银花质量评价的参考指标性成分。

图4 6 批不同种质金银花的OPLS-DA 图Fig.4 OPLS-DA maps of six batches of Lonicerae Japonicae Flos with different germplasm

3 讨论

3.1 UPLC 含量测定条件的优化

超高液相色谱分析法是一种高效的液相技术[5]，具有分析速度快、分离度好、检验准确率高等优点[6]，对中药的成分分析、中药鉴定等具有重要意义[7]。金银花成分含量多以普通高效液相色谱仪单波长检测为主[8-9]，本实验通过超高效液相色谱仪全波长扫描，选择12 种化学成分的最大吸收波长，分波段检测，可有效避免杂质峰的影响，提高有效成分含量测定结果的准确性。

3.2 不同发育期化学成分含量变化分析

本实验首次通过UPLC 分段波长测得亚特2 号、亚特立本、亚特4 号、亚特5 号、亚特6 号、亚特7号、亚特8 号、鸡爪花、小毛花、北花1 号不同发育期中12 种成分的含量。结果发现不同种质不同发育期的化学成分含量存在较大变化。首先绿原酸含量变化特点为，亚特2 号、亚特4 号、亚特6 号、亚特8号、小毛花、北花1 号在未开花期含量较高，鸡爪花在开花期含量较高，亚特立本、亚特7 号各发育期的绿原酸含量相差不大；其次，酚酸类成分绿原酸、异绿原酸A 和异绿原酸C 的总含量变化特点为，亚特2号、亚特4 号、亚特6 号、亚特7 号、亚特8 号、小毛花、北花1 号未开花期酚酸类成分含量较高，鸡爪花开花期酚酸类成分含量较高，亚特立本各发育期酚酸类成分含量相差不大。

3.3 指纹图谱的建立与相似度分析

中药指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，可以反映中药的整体化学特征[10]。目前，金银花指纹图谱主要是不同产地[11]、不同采收期[12]的研究，不同种质金银花的研究种类多为2～5种。本实验首次建立了对10 种不同种质金银花不同发育期药材的指纹图谱，种质丰富，且涵盖了国外引进的品种。

相似度分析结果显示，除亚特8 号三青时期的相似度为0.723 外，其余金银花样品相似度均大于0.91，表明不同种质金银花存在差异，但质量相对稳定。亚特8 号原产地为美国，该品种金银花具有特殊香气，且一年开花茬数较多，表明该种质具有一定的特殊性。

3.4 化学模式识别研究

化学模式识别将中药的复杂成分转变为对数据的解析，更有利于从整体上对中药质量进行评价与控制，在中药质量控制中的运用越来越广泛[13-14]。本实验对10 种金银花进行PCA，亚特4 号、亚特8 号被显著区分，且亚特8 号的PCA 结果与指纹图谱分析结果一致，均被明显区分。通过前期的PCA分析结果及预实验结果，从上述10 种金银花中筛选出亚特2 号、亚特立本、亚特4 号、亚特8 号、鸡爪花、北花1 号6 种，6 种不同种质不同发育期金银花通过PCA、OPLS-DA 被明显区分，并根据VIP 值＞1 筛选获得断氧化马钱子苷、新绿原酸、马钱苷、隐绿原酸4 种质量差异标志物。

本实验通过UPLC 指纹图谱与多成分化学模式识别研究相结合的方式，可有效评价不同种质金银花药材的质量差异性，为不同种质金银花鉴别提供新思路，为不同种质不同发育期金银花的质量评价提供参考。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突