基于非靶向代谢组学的老年胃癌患者术前衰弱与代谢综合征代谢特征研究

蒋小曼,郭银宁,缪雪怡,徐 婷,徐欣怡,3,陈 丽,季明辉,许 勤△

1.南京医科大学护理学院,江苏南京 211166;2.浙江大学医学院附属第一医院胃肠外科,浙江杭州 310003;3.昆士兰科技大学健康学院,澳大利亚昆士兰 4702;4.南京医科大学第一附属医院/江苏省人民医院普外科,江苏南京 211166

衰弱与代谢综合征(MetS)均是常见的老年人健康问题,可作为疾病负担加剧癌症患者不良预后的发生。既往研究显示,二者在发病机制层面可能存在密切联系[1],然而现阶段衰弱机制尚不明确,研究显示衰弱的发生机制可能涉及内分泌失调、炎症反应增强、免疫功能障碍、代谢失衡、氧化应激损伤等多个系统的病理生理过程,并且各系统间相互关联[2]。另外,癌症本身就是一种代谢性疾病,肿瘤细胞可改变代谢途径,造成代谢重编程,使机体处于特异性的代谢状态,并形成有别于正常细胞与其周围组织的微环境[3-4]。在此状态下,衰弱所形成的代谢特征及与MetS老年胃癌患者的间的联系尚不明确。代谢组学可以对机体小分子代谢物进行全面分析,从而反映基因组和环境在个体水平上相互作用的最终结果,在癌症患者的健康管理中具有重要价值[5]。因此,本研究基于非靶向代谢组学检测技术分析衰弱及MetS代谢特征,以及潜在作用途径,阐明其对监测术前营养代谢水平、确定干预靶点及制订精准衰弱管理方案的意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2021年8月至2022年8月南京医科大学第一附属医院/江苏省人民医院普外科胃外病区收治的58例胃癌老年患者为研究对象。(1)纳入标准:①年龄为65～80岁的老年人[6];②经胃镜与CT检查确诊为胃癌,初次接受胃癌根治术;③神志清楚,能进行简单书面及语言交流。(2)排除标准:①因严重躯体疾病、认知障碍或精神疾病无法配合完成研究;②患严重传染性疾病;③合并其他部位肿瘤;④存在严重心脑血管疾病,肝、肾及肺功能不全;⑤体内安装有金属医疗器械;⑥服用影响身体成分测量的药物;⑦术前接受过新辅助治疗[7]。根据诊断,以非衰弱非MetS的胃癌患者25例作为对照组,单纯衰弱胃癌患者10例作为衰弱组;单纯合并MetS的胃癌患者13例作为MetS组,衰弱合并MetS的胃癌患者10例作为合并组。采用Fried衰弱表型量表进行衰弱测量[8],采用《中国2型糖尿病防治指南(2020年版)》[9]作为MetS诊断标准。所有研究对象自愿配合参加本研究,并签订知情同意书,本研究经南京医科大学伦理审查委员会审查批准[批件号:南医大伦审(2022)746号],且在中国临床试验注册中心进行注册(注册号:ChiCTR2200060615)。

1.2仪器与试剂 主要仪器包括高分辨质谱仪(Q Exactive HFX,Thermo Fisher Scientific)、超高压液相色谱仪(Vanquish,Thermo Fisher Scientific)、离心机 (Heraeus Fresco17,Thermo Fisher Scientific)、天平(BSA124S-CW,Sartorius)、超声仪(PS-60AL,深圳雷德邦)。主要试剂包括甲醇、乙腈、乙酸铵、氨水、超纯水等。

1.3方法

1.3.1资料收集 采集患者年龄、性别、体质量指数(BMI)、合并症情况、服用药物数量(多重用药定义为同时服用≥4种药物)[10]、营养风险筛查量表2002(NRS2002)[11]、吸烟史、饮酒史、TNM肿瘤分期、腰围等临床资料。

1.3.2标本采集及预处理 嘱患者禁食12 h后于清晨空腹状态下采集肘正中静脉外周血5 mL,置于含抗凝剂乙二胺四乙酸(EDTA)的采血管中,混匀血液和抗凝剂,然后以4 ℃,1 300×g离心力离心10 min分离血清,—80 ℃冷冻保存标本。检测时室温解冻,移取100 μL标本至EP管中,加入400 μL提取液[甲醇∶乙腈=1∶1(V/V),含同位素标记内标混合物],振荡混匀后离心(4 ℃,12 000 r/min,15 min),取上清液于进样瓶中上机检测。所有标本另取等量上清液混合成QC样品上机检测。

1.3.3血浆样品分析条件 使用超高效液相色谱仪,通过Waters ACQUITY UPLC BEH Amide (2.1 mm × 100 mm,1.7 μm)液相色谱柱对目标化合物进行色谱分离。液相色谱A相为水相,含25 mmol/L乙酸铵和25 mmol/L氨水,B相为乙腈。样品盘温度:4 ℃;进样体积:2 μL。高分辨质谱仪能够在控制软件(Xcalibur,Thermo)控制下进行一级、二级质谱数据采集。详细参数如下:护套气流量30 Arb,辅助气流量25 Arb,毛细管温度350 ℃,全ms分辨率120 000,ms/ms分辨率7 500,碰撞能量NCE模式10/30/60,喷雾电压3.6 kV(+)或—3.2 kV(—)。

2 结 果

2.1各组基线资料比较 衰弱组年龄明显大于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);MetS组与合并组的BMI及合并症发生率明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);各组其他基线资料比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组基线资料比较或n(%)]

2.2多元统计分析结果 PCA结果显示,MetS组与对照组、衰弱组与对照组、合并组与对照组的x变量的解释性(R2X)分别为0.501、0.526、0.520,表明各组的预测率可达50.1%、52.6%、52.0%,并且3组模型的主成分个数均为6,各组间均存在明显生物学代谢差异,见图1 a、b、c。在此基础上,进行OPLS-DA,结果显示3组两样本间分离良好,代谢物轮廓存在明显区别,见图2a、b、c。MetS组与对照组、衰弱组与对照组、合并组与对照组的拟合度(R2Y)及预测度(Q2)分别为0.953与0.109、0.922与0.193、0.891与0.185。

注:a为MetS组与对照组;b为衰弱组与对照组;c为合并组与对照组;A为对照组;B为MetS组;C为衰弱组;D为合并组;PC1为主成分1;PC2为主成分2。

注:a为MetS组与对照组;b为衰弱组与对照组;c为合并组与对照组;A为对照组;B为MetS组;C为衰弱组;D为合并组;t[1]O为正交主成分得分;t[1]P为第一主成分的预测主成分得分。

2.3组间差异代谢物筛选 本研究使用的卡值标准为t检验的P<0.05且OPLS-DA模型第一主成分的VIP>1.0。根据代谢物的二级质谱碎片信息对化合物进行定性后筛选各组正负离子模式下全部差异代谢物。与对照组比较,MetS组共检测出41种具有明显差异的代谢产物,主要涉及氨基酸类(7个)、脂质类(甘油磷脂类9个、鞘脂类1个、脂肪酸类6个)及糖类(6个),除多数脂质代谢物明显上调外,其他代谢物多数明显下调。衰弱组患者共检测出32种具有明显差异的代谢产物,主要涉及氨基酸类(5个)与脂质类(甘油磷脂类10个、鞘脂类1个、脂肪酸类6个),其中植物鞘氨醇等鞘脂类代谢物及花生四烯酸、琥珀酸半醛、肉豆蔻酸、α-亚麻酸、10E,12Z-亚油酸5种脂肪酸类代谢物明显上调,精氨酰丙氨酸、N-乙酰缬氨酸、D-瓜氨酸、L-缬氨酸、L-天冬酰胺等5种氨基酸及大多数甘油磷脂类代谢物整体明显下调。合并组患者共检测出52种具有明显差异的代谢产物,涉及氨基酸类(9个)、脂质类(甘油磷脂类5个、鞘脂类3个、脂肪酸类5个)、核苷及核苷酸类(7个)、糖类(2个)及酸性化合物类(6个)等,其中假尿苷、N-乙酰胞嘧啶核苷、乳清酸核苷等5种核苷酸及多巴胺-3-O-硫酸盐等4种酸性化合物明显上调。植物鞘氨醇明显升高是衰弱组与合并组的共同特征。根据VIP值排序,各组前10种代谢物见表2～4。

表2 MetS组与对照组的差异代谢物信息

表3 衰弱组与对照组的差异代谢物信息

表4 合并组与对照组的差异代谢物信息

2.4差异代谢物的代谢通路分析 将筛选出的差异代谢物导入KEGG代谢通路数据库进行代谢通路富集分析,以Impact> 0.1且P<0.05为标准,筛选3组差异性代谢通路。与对照组比较,MetS组无明显代谢途径,衰弱组差异代谢物主要涉及丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢途径,合并组差异代谢物主要涉及甘油磷脂代谢途径,见表5。

表5 各组关键代谢途径及代谢物

3 讨 论

本研究以非衰弱非MetS老年胃癌患者为对照组,基于非靶向超高效液相色谱-质谱联用技术探究了衰弱组、MetS组与合并组的差异代谢物及代谢通路。结果显示,与对照组比较,MetS组以甘油磷脂类等脂质代谢物明显升高为特征;衰弱组以D-瓜氨酸、L-缬氨酸、L-天冬酰胺等氨基酸代谢物及多数甘油磷脂明显下降,且肉豆蔻酸、α-亚麻酸等脂肪酸及植物鞘氨醇明显升高为特征;合并组以假尿苷、N-乙酰胞嘧啶核苷、乳清酸核苷等核苷酸类代谢物及多种酸性化合物明显升高为特征。丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢途径在衰弱组中明显富集,甘油磷脂代谢途径在合并组中明显富集。

氨基酸代谢是蛋白质分解的中心内容,在肿瘤微环境中免疫细胞激活和功能发挥中也有重要作用[12]。与对照组比较,衰弱组精氨酰丙氨酸、N-乙酰缬氨酸、D-瓜氨酸、L-缬氨酸、L-天冬酰胺这5种氨基酸类物质全部明显下降,除了与衰弱过程中肌肉质量或力量减少外有关[13],NEPAL等[14]发现D-瓜氨酸、L-缬氨酸、L-天冬酰胺是与衰老相关的代谢物,提示衰弱与衰老之间可能存在相同的代谢物与调节通路。国外研究者基于欧洲MetaboFrail项目对衰弱合并糖尿病人群及衰弱对照人群进行了37种氨基酸靶向测定,揭示了老年糖尿病衰弱患者的特异性氨基酸代谢特征[15]。合并组产生明显代谢变化的谷氨酰胺[16]、谷胱甘肽[17]、N-乙酰-L-丙氨酸[18]、正缬氨酸[19]、(S)-β-氨基异丁酸[20]等氨基酸类物质已被发现与肿瘤发生、发展、治疗及预后密切相关,因此,未来研究可关注衰弱及MetS人群肿瘤相关代谢差异,揭示其氨基酸代谢模式。脂质代谢重编程是肿瘤代谢的重要特征之一,肿瘤细胞能够增加脂肪酸的摄取和氧化以产生能量和脂质积累,并且脂肪酸代谢异常可影响肿瘤发生、发展[21-22]。尽管衰弱组多数甘油磷脂类代谢物明显下调,但植物鞘氨醇这一鞘脂类代谢物明显升高,这也是衰弱组与合并组的共同特征。动物实验研究结果显示植物鞘氨醇与大鼠衰老存在正相关关系[23],提示衰弱组与合并组在衰老层面的代谢关联。此外,RATTRAY等[24]基于英国老龄化队列研究对1 191例人群进行血清非靶向分析,提出在衰弱状态下机体整体脂质发生改变,与衰弱相关的肉碱水平降低可能是细胞脂质代谢恶化的潜在迹象。代谢通路分析结果显示,合并组甘油磷脂代谢途径明显富集,尽管从临床诊断或评估指标层面合并组同时具备了衰弱与MetS的特征,但其脂肪代谢特征不同于其他两组,研究者需关注此组人群细胞脂质代谢情况,基于前瞻性研究验证其预后。

核苷酸代谢被认为是肿瘤发生和肿瘤细胞复制的最关键环节[25]。研究显示,肿瘤组织合成DNA和RNA的聚合酶活性较正常组织高,核苷酸合成增加且分解减少,因此,在癌症状态下核苷酸代谢物上调以满足肿瘤细胞不受控制和快速的自我增殖需求[26-27]。假尿苷[28]及N-乙酰胞嘧啶核苷[29]水平上调、5-甲基胞嘧啶[30]水平下调等合并组产生的核苷酸类代谢物质变化已被发现与癌症诊断、肿瘤侵袭转移、治疗及预后密切相关,这预示了合并组代谢异常受肿瘤细胞本身影响更大,后续需进一步关注肿瘤相关临床指标及治疗预后。另外,机体内酸碱平衡失调也是造成代谢差异的重要因素,例如酸性环境会增强泛酸介导的蛋白质降解途径并减弱肌肉生物合成相关信号通路,最终导致肌肉蛋白分解增加[31-32]。其中,酸中毒是肿瘤组织代谢环境的基本特征之一,表现为细胞内碱性和细胞外酸性的微环境[3]。本研究结果显示,合并组区别于其他组的代谢特征之一为多种酸性化合物明显升高,这可能与合并组患者较高的肿瘤分期有关。酸性细胞外环境可增加胆固醇合成酶的表达,有助于肿瘤细胞生长,并降低肿瘤患者生存率,因此,通过调节肿瘤微环境以改善肿瘤患者预后也是进行代谢调控的重要方式之一[33]。

本研究结果显示,与对照组比较,衰弱组丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢途径明显富集,合并组甘油磷脂代谢途径明显富集。ANGIONI等[34]基于MAPT研究数据进行了二次分析,区分了年龄相关衰弱与疾病相关衰弱的临床特征,并提出需根据具体特征采取不同的衰弱预防和管理策略。这提示尽管现有的评估工具可明确区分衰弱与非衰弱,但只能识别已发生的临床表现,不能反映衰弱相关的病理、生理过程,而相同的表型所对应的病因及疾病发展机制不同,即使给予同样的干预措施,所得效果也有所差异。未来可探索氨基酸或脂肪代谢调节对年龄相关衰弱与疾病相关衰弱人群衰弱发生、发展的作用,并制订特异性的代谢调节措施。

然而值得注意的是,OPLS-DA得到的R2Y表示模型的可解释性,R2Y>0.5说明所建模型有效性高,Q2表示模型的可预测性,Q2>0.45说明模型对于后续样本的预测结果合理,可做出有意义预测。在本研究中,3组R2Y均大于0.5,但Q2值较低,说明所建模型有效性较高,可解释各组两样本间的代谢物差异现象,但若有新的数据参与构建模型,对其分组准确度的可预测性较低。这可能与本研究所纳入样本较少、研究场所单一有关。

综上所述,衰弱的老年胃癌患者以氨基酸与甘油磷脂类代谢物明显下调、脂肪酸类代谢物明显上调为特征,合并MetS的老年胃癌患者以脂质类代谢物明显上调为特征。衰弱合并MetS患者存在氨基酸、脂质、核苷酸、酸性化合物等多类代谢物异常,可能与肿瘤相关代谢紊乱有关。未来研究者需关注相同衰弱表型下所对应的不同病因及疾病发展机制,给予针对性、靶向性的衰弱干预措施。然而本研究所纳入的样本较少,数据预测性不足,推广性有限,未来仍需要基于大样本血液检测数据对本研究结果进行验证。