单克隆抗体治疗炎性肠病耐药的研究进展

顾家博，韦平 综述，王俊，金黑鹰 审校

1.连云港市中医院肛肠科，江苏连云港 222004；

2.南京中医药大学第二临床医学院，江苏南京 210029；

3.江苏省第二中医院肛肠科，江苏南京 210017

炎性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）是一种由免疫介导的复杂性炎性疾病，包括溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）和克罗恩病（Crohn′s disease，CD），其典型特征包括肠上皮屏障功能障碍、肠道生态失调及肠黏膜免疫反应失调等［1］。IBD 病因复杂、病程长、难以治愈、易复发，治疗上以维持疾病缓解和预防复发为目标。目前治疗方案的选择建立在对病情全面评估的基础上，主要根据疾病的活动程度、病变累及范围、既往治疗方案及肠外表现等［2］。

随着对IBD 发生发展分子机制的深入研究，发现了许多相关的靶点分子，应用于对应靶点的单克隆抗体（简称单抗）已应用于临床治疗，英夫利昔单抗（infliximab）等新的生物制剂为IBD 的治疗提供了新的方法，但仍有10% ～15%的患者对这些药物产生原发性耐药，且在成功诱导和维持治疗后，约40%的患者会随着时间的推移失去临床应答［3］。虽然单抗产生耐药的机制尚未完全了解，但可从肿瘤治疗的相关研究中汲取经验，发掘出导致治疗耐药的众多分子机制。其耐药机制可能涉及目标蛋白下游信号通路中体细胞突变，宿主相关因素如肠道微生物菌群的改变或绕过靶向通路的代替信号通路的激活等［4-5］，克服耐药仍是一个严峻的挑战。本文对英夫利昔等单抗治疗IBD 耐药作一综述，以期了解其可能的机理，探索有效的治疗和预防措施。

1 单抗治疗IBD耐药发生的原因

1.1依赖抗抗体（anti-drug antibodies，ADAs）的原因使用生物制剂治疗疾病时，药物的免疫原性是重要问题。当药物引起免疫反应时，可通过中和药物的活性、增加药物的清除率对疗效产生影响［6］。抗肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）英夫利昔单抗一直是治疗中度至重度IBD的主要药物，在诱导和维持缓解临床症状、降低手术率及发生相关并发症风险上，疗效明确［7-8］。但仍有30% ～40%的患者可能对该药产生以原发性耐药为主的临床失应答，随着治疗的持续进行，有30%～40%的患者发生继发性耐药或不耐受而停用该药［9］。免疫原性是停止使用英夫利昔等单抗的最重要原因之一。免疫原性会导致对治疗的反应丧失，从而降低或消除治疗效果［10］，多体现在药物谷浓度（trough level，TL）过低或抗药抗体的产生［11］。ADAs 可中和连接到蛋白质Fab片段的抗TNF药物或仅结合抗TNF分子，促进免疫复合物的形成，这二者均导致抗TNF 药物通过网状内皮系统的清除率增加，会导致药物药代动力学改变并降低治疗效果。

ADAs 可能是通过T 细胞途径产生的［12］。单抗被抗原呈递细胞内化及加工后，通过MHCⅡ类分子与T 细胞受体的同源相互作用，以抗原的形式呈现给T 细胞。因为这种方式激活后的细胞因子环境将产生多种免疫应答反应［13］。当T辅助细胞（T helper，Th）分化为Th1 或Th2 表型时，会产生ADAs，并在它们与B 细胞相互作用后，诱导分泌ADAs 的浆细胞增殖，从而产生ADAs。如输注英夫利昔单抗后，可检测到特异性Th2 细胞，这些细胞与英夫利昔单抗特异性ADA 的存在相关［14］。ADAs 的产生还可能与HLADQA1*05（rs2097432）基因的遗传变异有关，出现耐药及其他相关并发症的风险是未出现变异患者的6倍［15］。

1.2不依赖ADAs的原因

维得利珠单抗（vedolizumab）在治疗IBD 时，一部分ADAs 阳性患者TL 偏低导致治疗效果欠佳停止用药，一部分ADAs 阴性或ADAs 短暂存在、浓度较低的患者仍有的因疗效欠佳停止治疗，表明不产生ADAs 或ADAs 浓度不高同样会产生耐药，免疫原性并不是治疗失败，发生耐药的原因。对不依赖ADAs 的单抗治疗IBD 耐药的机理，尚缺乏统一的认识，其耐药的原因可能是淋巴细胞运输不足导致的机械性失败和药代动力学差异导致的药物浓度不足［16］。

目前针对治疗IBD 的单抗，如英夫利昔单抗、阿达木单抗、维得利珠单抗及乌司奴单抗（ustekinumab）等，其耐药机制尚不明确，借鉴常见的肿瘤耐药机制［17］，将耐药机制分为以下几类。

1.2.1PRSS丝氨酸蛋白酶切割单克隆抗体 有研究表明［18］，一种丝氨酸蛋白酶PRSS在单抗治疗中产生耐药的重要作用，PRSS 的表达水平与细胞对西妥昔单抗的敏感性呈负相关。PRSS可在体内和体外切割所有的单抗，可抑制西妥昔单抗介导的PI3K／AKT和MEK／ERK 信号通路的传导，同时修饰过的单抗可避免PRSS 介导的切割作用。在体外试验中，联合使用PRSS 抑制剂减少了对单抗的切割作用，抑制了肿瘤细胞的生长。该研究揭示了PRSS 降低了单抗的疗效，最终导致了耐药的发生。

1.2.2抑瘤素M（oncostatin M，OSM）介导炎性相关成纤维细胞（inflammatory associated fibroblasts，IAFs）和炎性单核细胞对TNF屏障进行补偿 IBD患者的肠道组织内大量表达细胞因子OSM及其受体（OSMR），OSM 在治疗前的高表达与抗TNF-α 单抗治疗失败密切相关［19］。有研究对耐药性和敏感性患者的基因特征进行分析［20］，发现耐药性特征基因IL13RA2、TNFRSF11B和IL11在IAFs、炎性单核细胞和DC2中高度富集，这3 个与耐药相关的基因是IAFs 的标记物，且在其他细胞中几乎不表达；而敏感性特征基因则在上皮细胞中高度富集。IAFs中最丰富的基因之一是OSMR，该受体是预测抗TNF-α 单抗耐药的细胞因子，OSM 在炎性单核细胞和DC2 中富集，OSMR 在IAFs中富集。经实验证实，IAFs在耐药患者中富集。研究通过验证OSM 激活了IAFs 的下游靶点，对TNF屏障进行补偿，证实了TNF 与OSM 信号传导间存在相关性，从而导致了耐药。因此推测，抗TNF-α 单抗治疗IBD 的耐药机制与OSM 介导的IAFs 和炎性单核细胞有关。

1.2.3调节性T 细胞亚群或α1 整合素亚基在T 细胞中表达异常 α1整合素亚基介导了抗TNF 治疗的耐药。实验通过对IBD 患者的肠道活检组织检查进行了单细胞RNA 测序，分析并结合了公开可用的免疫细胞蛋白质组学数据，发现导致耐药的细胞类型与α1 整合素亚基在T 细胞中表达有关［21］。抑制α1 整合素亚基增强了英夫利昔单抗在免疫细胞中的细胞因子抑制作用，增强了IBD 患者对抗TNF 治疗的临床应答。

针对抗α4β7 整合素抗体维多利珠单抗（vedolizumab）耐药的机制，近期有研究表明，其与β1+PI16+调节性T 细胞亚群的富集有关［22］。研究通过单细胞RNA 测序法确定了β1+PI16+调节性T 细胞亚群对维多利珠单抗的抵抗，通过体外试验结合临床上收集的治疗前后IBD 患者结肠活检组织，验证了该细胞亚群是维多珠单抗与调节性T 细胞和效应性T 细胞结合的底物，且降低了与维多利珠单抗的结合，导致了耐药。

1.2.4p53 通路突变阻断凋亡信号通路 p53 通路的表达异常或突变与耐药性有关［23］，包括顺铂、烷化剂（替莫唑胺）、蒽环类药物（多柔比星）、抗代谢药（吉西他滨）、抗雌激素（他莫昔芬）和表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）抑制剂（西妥昔单抗）等。研究表明，突变的p53通路增加与Nrf2 启动子的结合而上调Nrf2，并激活NF-κB 信号通路导致Nrf2 表达增强［24］。在耐替莫唑胺的治疗中［25］，突变的p53通路和O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）之间存在相关性，替莫唑胺通过烷基化鸟嘌呤杀死细胞，而MGMT 反过来修复烷基化。因此推测耐药性可能与MGMT 高表达相关。突变的p53 通路诱导突变靶基因细胞周期蛋白依赖性激酶1（cyclin dependent kinase 1，CdK1）和有丝分裂特异性细胞周期蛋白-B1（cyclin B1，CCNB1）的表达，二者均参与有丝分裂和细胞增殖，导致吉西他滨的治疗耐药［26］。p53通路影响ERK和ERK介导的早期生长反应因子-1（early growth response-1，Egr-1）转录，反过来又增加了EGFR 的分泌，导致EGFR 信号传导增强，从而使西妥昔单抗等EGFR抑制剂治疗无效［27］。

1.2.5细胞自噬调控耐药 细胞自噬是一种高度保守的细胞过程，细胞质材料被降解和回收以维持能量稳态。借鉴单抗在肿瘤治疗中耐药与自噬的关系，自噬可调节耐药的进展［17］。细胞自噬表现出细胞保护功能时，自噬抑制剂的使用可增强生物制剂的敏感性，表明自噬可能在耐药细胞中起到保护作用［28］；相反，自噬表达细胞毒性功能时，可诱导耐药细胞的死亡。mTOR 通路是自噬的负调节因子，mTOR 的抑制剂通过抑制细胞自噬通路，诱导小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3、耐药株LoVo／ADR 结肠癌细胞和顺铂耐药宫颈癌细胞死亡，耐药细胞缺乏凋亡能力或表现出凋亡抵抗时，诱导细胞自噬的药物也可阻止耐药的产生［29］。mTOR 复合体介导MAPK 和PI3K／AKT 信号通路导致肿瘤治疗产生耐药，如肺癌顺铂耐药、乳腺癌PI3K 抑制剂耐药和黑色素瘤TORC1 抑制剂耐药，均受mTOR 复合体的影响［30］。鉴于mTOR 为治疗耐药性的广泛驱动因素，使肿瘤细胞对生物制剂产生耐药性，同时抑制自噬的表达，在IBD 的治疗中，可尝试基于细胞自噬，寻找合适的自噬抑制方法，降低单抗的耐药。

2 单抗治疗IBD耐药的监测

目前，耐药的产生不可避免，确定并量化评估耐药的指标，及时优化调整现有的治疗放方案显得尤为重要。目前尚缺乏针对耐药敏感度和特异性均理想的预测手段，但在治疗IBD 方面，可能存在相关预测因子，并可指导临床治疗方案的优化。研究表明，治疗药物的监测（therapeutic drug monitoring，TDM）、检测药物TL和ADAs的表达可能有益于针对抗TNFα治疗失去临床应答的患者［31］。药物TL与临床活动指数（clinical activity index，CAI）比值是预测治疗结果的独立因子，可能预测出对英夫利昔单抗治疗失去临床应答的发生［32］。使用阿达木单抗治疗时，ADAs的产生和低药物TL 是存在的，ADAs 阳性被确定为临床失应答的预测因子［33］，但低药物TL 对耐药的产生是否是独立影响因素并无统一的结论［34］，需要多中心、大样本的数据支持。在使用乌司奴单抗治疗时，血清药物浓度与临床缓解存在相关性，但其ADAs形成率很低，只有不足5%［35-36］，而有超过近4 成的患者仍存在临床失应答，表明ADAs的产生可能不是产生耐药的预测因子。治疗IBD 的耐药机制与OSM 介导的IAFs 和炎性单核细胞有关，那么OSM 也可是IBD的预测因子［37］。

有研究表明，粪便钙卫蛋白是IBD 内镜下活动情况的预测因子［38］。对疾病监测、生物治疗疗效、黏膜愈合及黏膜组织学愈合评估有意义。相比于传统的炎症标志物，粪便钙卫蛋白具有高敏感性和高特异性，对溃疡性结肠炎活动性预测准确率更高，总体内镜下疾病活动性识别率高达近90%。钙卫蛋白在粪便中分布相对均匀，抗酶降解，存活时间长，不受多次冻融循环的影响，且易于测量、价格低廉，被证明是肠道炎症的有效标志物，可预测复发和临床疗效［39］。除了粪便钙卫蛋白外，血清二肽基肽酶4 也被认为是IBD 疾病活动和预后的预测因子［40］。因此，预测指标的选择，可使临床医生以预防的方式优化治疗方案，从而避免疾病进展。

3 单抗治疗IBD缓解耐药的策略

失去临床应答产生耐药时，生物制剂不同的作用机制使更换新的药物后，患者可重新获得临床缓解，新靶点的发掘也有利于新兴生物制剂的研发。但由于初期高昂的治疗费用，频繁更换靶向药物似乎不适用于大部分患者。产生耐药时，可考虑增加剂量或缩短间隔时间，或添加、调整免疫抑制剂的选择，以重新获得临床应答，避免停药。一些学者建议在使用生物制剂的同时联合使用免疫抑制剂，达到增加临床疗效，缓解耐药的目的。已有研究表明，英夫利昔单抗与硫唑嘌呤（azathioprine，AZA）联合应用是治疗IBD 更优选的方案［41-42］。因为免疫抑制剂减少了针对抗TNF-α 药物的抗体的形成，从而防止抗体降低或消除［43］。同时，免疫抑制剂的联合使用可增加生物制剂治疗的持久性。更重要的是，有明确证据表明，早期接受免疫抑制剂的患者在生物治疗上停留的时间更长。潜在的原因除了减少ADAs的形成外，还可能增加了抗炎作用［44］。但同时，联合使用免疫抑制剂会增加感染和患淋巴瘤等风险［45］，出于安全考虑，联合疗法的使用需要丰富的临床经验。

抑制自噬可预防耐药并改善抗肿瘤治疗疗效［46］。自噬是真核生物进化过程中的一个保守过程，通过该过程，细胞质材料在溶酶体内被降解，在肿瘤发展的早期阶段发挥保护作用，调节正常细胞中的致癌基因和分子，有证据表明，自噬能抑制肿瘤转化［47］。基础研究和临床试验表明，抑制细胞自噬可提高抗肿瘤药物的疗效及肿瘤相关抗原的单抗有效性。扩大细胞自噬抑制剂的使用，如检查点阻断抗体和其他生长受体抑制剂，并联合现有免疫治疗药物，为新的疗法打开了前景。同样是使用单抗治疗时产生的耐药，细胞自噬抑制剂的应用是否可抑制IBD 的发展，提高治疗效果仍需进一步研究。

4 小结及展望

多年来，抗TNF-α单抗是唯一批准用于治疗IBD的生物制剂。近几年，也有针对α4β7 整合素的人源化单抗维多利珠单抗［48］及针对IL-12 和IL-23 的p40亚基的乌司奴单抗［49］用于临床治疗，在诱导和维持中重度溃疡性结肠炎患者症状缓解上均有效。但在不断扩大的新型靶向生物疗法中，无论是抗TNF-α抗体、抗α4β7 整合素抗体或抗IL 抗体，原发性或继发性耐药问题均成为除临床疗效及安全性外最重要的关注点之一［50］。越来越多的基层医院选择生物制剂治疗IBD，随着生物制剂使用的普及，多中心、大样本的临床实验会为更好地应用生物制剂治疗IBD提供数据支持。