骨肉瘤细胞生长的自分泌和旁分泌调节的研究进展

杜少文，刘翔 综述，叶凯山 审校

兰州大学第二医院骨科甘肃省骨关节疾病重点实验室，甘肃兰州 730000

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是一种间充质来源的侵袭性骨样生成肿瘤，其形成病因复杂且无法确定，因其细胞可产生骨样基质而导致被称为“日光爆发”模式的典型影像学表现［1］。OS常发生于儿童和青少年，好发部位在四肢长骨干骺端，其中一半以上的病例发生于膝关节周围，具有进展快、预后差的特点。虽然目前的治疗策略，如新辅助化疗联合手术对OS是有效的，患者的5 年生存率可提高至65%，但在过去的30年中，患者的生存率并未显著提高［2］，而且大多数化疗药物均有严重的副作用，治疗结果仍不佳，高死亡率和预后差也无明显改善［3］。在过去的几十年里，人们进行大量研究来证明与OS 细胞生长调节有关的因素，表明细胞因子（cytokine，CK）的复杂网络是最重要的调节因素之一［4］。

CK 作为细胞间信使的小蛋白质，在免疫系统中发挥重要作用，并控制不同细胞类型的分化和生长［5］。CK由肿瘤细胞和肿瘤微环境通过自分泌及旁分泌途径产生，作为恶性肿瘤演变发展的激活剂或介质发挥作用。在致癌过程中，CK 参与肿瘤细胞的增殖、转移和侵袭以及血管生成。CK 不仅影响肿瘤的发展，其受体也与肿瘤密切相关。免疫系统在对抗恶性肿瘤中起至关重要的作用。个体CK 对免疫系统的影响取决于局部CK 浓度、特异性受体的表达和多种信号通路的激活［6］。肿瘤与免疫系统之间的相互作用以及肿瘤本身产生的CK 可导致癌症患者体内高水平的CK，表明CK 可潜在地用作诊断生物标志物及预后评估［6-7］。目前，在OS中已发现多种与血管生成、肿瘤细胞增殖和转移相关的CK 及其受体，其中部分CK与患者的预后及病程发展密切相关，如胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、趋化因子5（C-X-C motif chemokine ligand 5，CXCL5）、白细胞介素-8（interleukin-8，IL-8）等，它们各自通过激活不同的信号通路来参与OS 的发生发展过程。因此，了解OS 细胞生长的自分泌和旁分泌CK 的调节非常重要，以便使用特定的免疫学、生物化学或生物技术工具来中断该刺激过程，为OS 患者的诊断及治疗提供策略。

本文对CK 的作用、作用方式及其与OS 细胞的生物学相关性作一综述，以期为OS 的临床治疗提供有效的新标志物和治疗靶点。

1 IGF-1

IGF-1属于IGF家族成员，其基因位于第12号染色体，多肽链由70个氨基酸构成［8］，主要在人体组织器官的生长发育中发挥作用。IGF-1系统包括IGF-1、IGF结合蛋白和IGF-1受体（IGF-1R）［9］。

近年研究发现，IGF-1 及IGF-1R 的高度表达与致癌作用密切相关，有助于肿瘤细胞的存活、转移及对化疗药物的耐药性，且被认为是影响多种人类癌症（包括卵巢癌）发展的危险因素［9］。大量临床和基础研究已证明，IGF-1也对骨肿瘤的演变发展起重要作用［9］。LI 等［9］、SERGI 等［10］、HU 等［11］、WANG 等［12］研究发现，OS 细胞中的IGF-1 主要来源于两条途径，即肝脏合成和OS 细胞、成骨细胞等自分泌、旁分泌产生，并作用于OS细胞，影响其演变发展。其他组织如大脑、肌肉等也可合成IGF-1，用于自分泌或旁分泌作用。OS 细胞中自分泌和旁分泌来源的IGF-1 对OS的影响主要是通过与IGF-1R结合而发挥作用［12］，但也有研究发现，其还可通过与胰岛素受体（insulin receptor，IR）结合发挥同样的作用［11］。IGF-1在OS中的作用机制是通过与IGF-1R结合，使IGF-1R自动磷酸化，激活PI3K／AKT 和Ras／MAPK 两条信号通路。而PI3K／AKT 信号通路的激活与OS 的发病机制密切相关［13］，可抑制OS 细胞的凋亡，导致蛋白质的合成增强，从而促进OS 细胞的增殖和化疗耐药性［9，11-13］。Ras／MAPK 尽管在体内尚未发现与OS 相关，但与OS 细胞增殖和侵袭增加及上皮间质转化（epithelial mesenchymal transformation，EMT）导致的转移有关［14］。而且体外研究表明，IGF-1可将癌细胞从化疗药物诱导的凋亡中解救出来，其高表达与转移表型相关［15］。JENTZSCH 等［16］通过组织微阵列发现局部IGF-1 的表达与侵袭性高的肿瘤类型和生存期有关。2015年，MANISCALCO 等［17］研究证实，IGF-1R 的过度表达与OS 患者手术分期和远处转移密切相关。IGF-1R的过表达也与OS中的肿瘤增殖、侵袭和迁移相关，其作用机制也是受体-配体相互作用启动酪氨酸残基的受体自动磷酸化，随后激活多种信号通路，包括丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）和磷酸肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）信号通路。

现代分子药物疗法的发展使某些肿瘤标志物得以被发现，近些年的研究尝试采用IGF-1作为操作系统的诊断标记物，而靶向局部IGF-1途径的新型药物也许会提高治疗的成功率［9］。WANG 等［18］研究发现，IGF-1R 是miR-503 的新靶向基因，可通过直接抑制IGF-1R来抑制OS U2OS细胞增殖和侵袭。CHIU等［19］通过分子模型、免疫沉淀、蛋白质印迹和酶联免疫吸附试验等表明，6-氟-2-（3-氟苯基）4-（氰基苯胺基）喹唑啉（HMJ-30）可选择性地靶向IGF-1R 的ATP 结合位点，并抑制其下游PI3K／AKT和Ras／MAPK信号通路，下调基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase，MMP-2）和MMP-9 的表达，进而抑制OS U2OS 细胞的侵袭和迁移。ZHENG 等［20］研究表明，钩端螺旋体素（leptocarpin，LTC）也能通过抑制IGF-1R 的表达来抑制OS 的增殖、迁移和侵袭。因此，miR-503可能是一个有前景的OS 治疗靶点，可应用于OS 的基因治疗，而HMJ-30 和LTC 可能是未来治疗OS 的候选药物。

2 TGF-β

TGF-β 是一种属于跨膜受体家族的CK，该家族中有33 个成员，如TGF-β1、TGF-β2 等［21］。TGF-β 超家族几乎参与了细胞活动的各个方面，对正常细胞和肿瘤细胞均有不同的作用，即生理条件下，参与血管生成的调节和细胞骨架、细胞外基质以及肌肉骨骼系统的构成。而近年来研究发现，TGF-β 与癌症发生有关，被认为在肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭中起关键作用［22-23］。

TGF-β 是人类OS 进展过程中肿瘤微环境的一种丰富的CK。FRANCK等［24］研究发现，OS细胞或间质细胞分泌TGF-β 可有效地以自分泌和旁分泌方式调节微环境的表型和功能，即促进血管生成、骨重塑和细胞迁移，以及通过抑制免疫监视，在OS中发挥其原生功能。目前研究发现，TGF-β 在肿瘤形成过程中发挥双重作用，即在肿瘤早期，TGF-β 作为抑制增殖因子，通过诱导细胞凋亡和阻碍细胞周期而发挥抑制肿瘤生长的作用；而在肿瘤后期，TGF-β 可促进肿瘤细胞的增殖［25］。

TGF-β 在OS 形成早期，通过诱导细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的分泌导致细胞凋亡，或降低细胞增殖驱动因子c-Myc 的表达而发挥肿瘤抑制作用［24］。其在OS 形成的晚期发挥肿瘤促进作用，即通过经典信号通路和非经典信号通路参与OS 细胞的增殖、迁移和侵袭。经典信号通路又称Smads级联反应：主要通过Smad蛋白传递，即TGF-β二聚体通过结合两种不同膜细胞表面丝氨酸／苏氨酸激酶受体（TβRⅠ／TβRⅡ受体），诱导两个TβRⅠ受体和两个TβRⅡ受体组装成异四聚体复合物，其中TβRⅡ磷酸化并激活TβRⅠ受体，然后Smad3被TβRⅠ磷酸化和激活，激活的Smad3 从受体激活蛋白的Smad 锚中分离出来，并招募Smad4。酸化的Smad2／3 与Smad4形成复合物被转运到细胞核中，与辅因子一起调节靶基因的表达，进而促进OS 细胞的增殖、转移和侵袭［26］。非经典信号：TGF-β 信号通过激活丝裂原活化蛋白激酶和PI3K／AKT 信号通路，发挥肿瘤形成前期的抑制作用，从而抑制OS细胞的增殖［24］。

ZHOU 等［27］研究发现，TGF-β 表达越高，肿瘤坏死率越低，OS 患者越易产生化疗耐药性，导致预后不良。2019 年，ZHANG 等［21］通过实验表明，雌激素受体β 过表达可通过下调TNG-β 信号通路来抑制细胞增殖、迁移和侵袭，阻断细胞周期，促进凋亡和自噬。因此，成功阻断TGF-β 信号，有望成为治疗OS的一种新策略。虽然近年已研制出可阻断TGF-β 信号的药物，如可溶性TGF-β 受体或受体激酶抑制剂，但临床试验的效果并不理想［28］。而LAMORA 等［29］在体外实验中发现，常山酮可抑制TGF-β／Smad3级联和参与转移扩散过程的TGF-β关键靶标如MMP-2的反应，进而减少原发性OS的发展和相关的肺转移。因此，常山酮可能是一个有希望的治疗策略，特别是针对肺转移扩散的OS肿瘤进展。

3 CXCL5

CXCL5 是趋化因子CXC 亚家族的成员，基因定位于4 号染色体q13-q21 部位［30］，主要作用是引诱中性粒细胞促进新生血管的形成。其既能由免疫细胞、非免疫细胞分泌，也能由肿瘤细胞分泌［31］。

近年研究发现，肿瘤和基质细胞分泌的趋化因子可引诱肿瘤相关白细胞的表达和分布，触发血管生成，促进肿瘤细胞的生长和迁移，而CXCL5被认为是促进人类肿瘤发展和进展的关键趋化因子［32］。CXCL5 作为体内外肿瘤血管生成的积极调节因子，通过与受体CXCR2 结合后，可诱导中性粒细胞的趋化性，促进血管生成，启动细胞的修复和增殖功能，并提高细胞的活动能力，从而导致细胞发生转移［33］。WANG等［34］的研究显示，CXCL5在膀胱癌中上调，且CXCL5的高表达与膀胱癌患者的分期、恶性程度、淋巴结转移和不良预后密切相关。目前，DANG等［35］通过实时定量聚合酶链反应和蛋白质印迹法发现，CXCL5 蛋白在OS 组织中的表达显著增加，且主要以自分泌和旁分泌的方式调节OS的生长。DANG等又通过伤口愈合试验和Transwell 试验发现，OS 细胞迁移和侵袭也与CXCL5的高表达显著相关。CXCL5对OS的调控机制主要是通过与其受体CXCR2结合，激活MAPK 信号通路途径，癌细胞被吸引至转移性部位，从而促进OS 细胞的转移和侵袭［36］，且激活的MAPK 途径与OS 预后差密切相关［37］。在以往的研究中发现，CXCL5 和受体CXCR2 形成的生物轴也可刺激肿瘤生长和血管生成，并促进宿主细胞的浸润和活化［36］。此外，CUI 等［38］研究发现，CXCL5 与其受体结合，还可激活JNK 和p38 MAPK 通路来促进OS细胞的增殖。

LABELLE等［39］研究表明，CXCL5还通过CXCL5／CXCR2 轴以旁分泌的方式招募CD11b+MMP-9+Ly6g+粒细胞来促进早期转移龛影的形成。在OS 治疗方面，阻断CXCL5／CXCR2 轴是抑制肿瘤细胞生长和提高治疗敏感性的有效方法。另外，研究发现，SCH-527123 作为一种新型的选择性CXCR2 拮抗剂，可通过阻断MAPK 信号通路减少血运重建，进而延缓肿瘤进展［40］。基于这些临床前的研究结果，CXCL5／CXCR2轴和CXCR2可作为OS新的治疗靶点。

4 IL-8

IL-8是CXC 趋化因子家族的成员，也称CXCL8，基因定位于4号染色体q12-q13部位。IL-8既能由中心粒细胞、内皮细胞等产生，也可由肿瘤细胞分泌。其不仅参与炎性反应，也与血管生成的过程密切相关。目前已发现IL-8在一系列人类恶性肿瘤中过度表达，包括肺癌、胃癌和乳腺癌，因此，其可能是构成实体肿瘤发展的危险因素［41］。

研究表明，IL-8 参与了包括OS 在内的多种肿瘤的演变发展，其可能通过调节免疫反应和肿瘤细胞增殖，使肿瘤细胞迁移到内皮细胞，进而通过增加胶原酶活性，提高肿瘤细胞体积，从而影响肿瘤的发展［42］。CAMPBELL 等［43］的实验结果显示，OS 细胞和骨髓间充质干细胞均分泌IL-8作为自分泌和旁分泌因子，在OS 微环境中可刺激OS 细胞分泌的MMP-1和MMP-3 增多，从而促使肿瘤血管生成。KAWANO等［44］通过共培养实验也发现，OS 细胞是利用自分泌和旁分泌机制释放IL-8来促进自身生长。KAWANO等的研究显示，IL-8 在OS 中调节其发展的机制是通过诱导FAK 和AKT 信号的激活来实现的，而且通过在共培养的细胞中加入抗IL-8 的中和抗体后，肺转移的形成明显减少［44-45］。IL-8 也可能有抑制晚期凋亡细胞诱导的抗肿瘤反应的作用，从而加重OS 的进展。JIANG 等［46］发现，IL-8 在OS 的免疫反应中表现出双重性，即通过CXCL8-CXCR1／2 轴促进肿瘤抵抗和激活上皮-巨噬细胞转变（epithelial macrophage transformation，EMT）。肿瘤源性IL-8 增加了中性粒细胞和髓源性抑制细胞的浸润和募集，导致肿瘤微环境进入免疫激活状态。此外，招募的肿瘤相关中性粒细胞还通过分泌炎性细胞因子和趋化因子促进适应性抗肿瘤免疫反应。

体外研究证明，在宫颈癌的异种移植模型中，阻断IL-8 会出现明显的抗肿瘤效果［47］。IL-8 是包括增殖、侵袭和迁移在内的许多重要致瘤表型的最重要因素之一。IL-8 的高表达还与OS 的预后差及对化疗的耐药性有关［48］。因此，IL-8 高表达的检测可能为OS 的预防、诊断以及预后的判断提供重要依据。

5 小结及展望

CK 作为细胞间的信使，在免疫系统中发挥重要作用，可通过刺激或抑制细胞应对一系列反应。肿瘤的发生发展与免疫系统密切相关，其中CK 发挥着不可或缺的作用，且在OS中也不例外。

OS 是一种危及生命的疾病，尽管现代多模式的化疗、放疗取得了效果，但由于转移和局部复发的风险，OS 的治疗效果仍不佳。因此，深入了解OS 的发病机制对于开发新的有效治疗策略十分必要。多项研究已证明，OS 细胞及其微环境通过自分泌与旁分泌作用释放多种CK，如IGF-1、TGF-β、CXCL5、IL-8等，在其发病机制中起着重要作用；通过体外实验沉默CK 的表达，抑制IGF-1、TGF-β、CXCL5、IL-8等CK激活的信号通路，如PI3K／AKT、JNK、Ras／MAPK及FAK 等，证明可抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移以及耐药性［49-50］。而且，已有一种IGF-1R抑制剂R1507被用于一项队列研究，即治疗2岁及2岁以上复发或难治性OS（https：／／clinicaltrials.gov／ct2／show／study／NCT00642941），其结果尚未公布［9］。因此，探索CK激活的信号通路的功能及其与肿瘤发生发展的关系，可进一步了解CK 及其受体在OS 中的调节机制，最终研究设计CK 及其受体的抑制物，并通过靶向与其对应的信号通路阻断其功能，从而为OS 发展的预测及治疗干预提供新的思路。