Hib荚膜多糖在疫苗制备周期中的结构稳定性

张腾腾，秦春君，尹珊珊，刘翠，刘建凯，尹健，佟巍

1.北京民海生物科技有限公司，北京 102600；

2.江南大学生物工程学院糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏无锡 214122

b 型流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzaetype b，Hib）是引起儿童侵袭性细菌感染的主要原因之一［1］。儿童感染后会引起脑膜炎、肺炎、败血症、化脓性关节炎、骨髓炎、心包炎、蜂窝织炎、会厌炎等疾病［2-3］。Hib的主要毒力因子为荚膜多糖（capsular polysaccharide，CPS），其基本单元为聚核糖基核糖醇磷酸酯（polyribosylribitol phosphate，PRP），具有较好的免疫原性，能在人体中诱导产生保护性抗体［4-5］。预防和控制Hib 传染病的有效措施是接种Hib 疫苗［6-7］。由于多糖疫苗不能引发T 细胞依赖型免疫反应，在婴幼儿中保护效果较差，现已被结合疫苗取代［8-9］。Hib 结合疫苗是将多糖PRP 与载体蛋白通过共价键连接，使其由非T 细胞依赖性抗原转变成T 细胞依赖性抗原，从而激发细胞免疫，产生免疫记忆［7，10-11］。Hib荚膜多糖PRP重复单元的结构见图1［12］。

图1 Hib荚膜多糖PRP重复单元结构图Fig.1 Structure diagram of Hib capsular polysaccharide PRP repeat unit

核磁共振波谱（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）技术是研究原子核对射频辐射的吸收，类似红外或紫外光谱，在适当的磁场条件下，样品能够吸收射频区的电辐射，而且所吸收的辐射频率取决于样品特性，用吸收峰频率对吸收峰强度绘图构成NMR谱图［13］。NMR是对各种有机物、无机物的成分或结构进行定性或定量分析的最有效工具之一，其在分析化学、生命科学、材料检测等领域广泛应用［14-18］。特别是2D NMR 的出现和发展，使NMR成为糖类物质结构解析的主要工具［19］。

结构是多糖活性的基础，不同化学结构的多糖具有不同的生物活性，解析多糖的结构是揭示其构效关系的关键环节［20-21］。Hib 结合疫苗制备过程中存在剧烈的化学反应。为探讨Hib 结合疫苗制备过程中PRP 的结构变化情况，本研究采用1H-NMR、13CNMR、31P-NMR及1H-1H COSY、1H-13C HSQC等2D-NMR技术，探讨Hib PRP 在疫苗制备周期中的结构变化，以期评价Hib PRP在疫苗制备周期中的稳定性。

1 材料与方法

1.1菌株 Hib菌种源自常州市第二人民医院3月龄重症肺炎患儿，编号：MH200201［22］。本研究获得江南大学医学伦理委员会批准（JNU20020104IRB09）。

1.2主要试剂及仪器 胰蛋白胨购自美国Thermo Fisher公司；酵母浸出粉购自德国MERCK公司；破伤风类毒素购自北京民海生物科技有限公司；十六烷基三甲基溴化铵购自美国VWR Chemicals LLC；酪蛋白胨、氯化血红素、辅酶、溴化氰、己二酰肼（ADH）、碳二亚胺、乙腈购自美国SIGMA-ALDRICH 公司；Sepharose 4 Fast Flow 购自美国Cytiva 公司；600 L 发酵罐购自上海高机生物工程有限公司；pH 计购自瑞士梅特勒托利多；层析系统购自美国GE公司；400 MHz核磁共振谱仪和DRX 600 MHz核磁共振波谱仪购自德国Bruker公司。

1.3Hib 精制多糖的制备 将Hib 菌种于35 ～38 ℃条件下培养14 ～20 h，传2代后，于36 ～38 ℃条件下培养2 ～5 h，再传2代，按A550为0.05 ～0.3时的接种密度接种至600 L发酵罐，控制pH为7 ～7.2、温度为36 ～38 ℃，进行发酵培养，并适时补充500 g／L葡糖糖，6 h后停止发酵，加入1%甲醛溶液灭活。将灭活的发酵液（12 000 ～20 000）×g连续流去菌体后，采用十六烷基三甲基溴化铵沉淀收集复合多糖，再经乙醇、丙酮、苯酚进一步提取，得到Hib精制多糖。试验重复2 次。获得3 批（34-20011001、34-20011002、34-20031003）Hib 精制多糖。按照《中国药典》三部（2020版）［23］要求进行相关检测。

1.4Hib多糖衍生物的制备 参考尹珊珊［24］方法，使用氯化钠溶液分别溶解34-20011001、34-20011002、34-20031003 批Hib 精制多糖，并调节pH 至10 ～11，按照（0.5 ～1.0）mg 溴化氰／mg 多糖的比例，加入溴化氰溶液，活化多糖；多糖活化后，再次调节pH 至8.5 ～9.5，按照3.5 mg ADH／mg 多糖的比例，加入ADH 溶液衍生多糖，使ADH 与多糖共价连接；用氯化钠溶液从衍生后多糖溶液中置换出残留溴化氰、ADH 等杂质，获得Hib 多糖衍生物。试验重复2 次。获得3 批（34-20123038、34-20123041、34-20123044）Hib 多糖衍生物。按照《中国药典》三部（2020 版）［23］要求进行相关检测。

1.5Hib 多糖蛋白结合物的制备将Hib 多糖衍生物的pH 调节至5.7±0.3，参考孙晓东等［22］方法，按照破伤风类毒素∶多糖质量比为0.8∶1 ～1∶1，向多糖衍生物中加入破伤风类毒素。同时向上述反应体系中加入碳二亚胺至终浓度为20 ～60 mg／mL，并维持pH 为5.8±0.3，于2 ～8 ℃反应2 ～6 h，以便破伤风类毒素通过ADH 与多糖共价连接；结合物经氯化钠溶液透析后，用Sepharose 4 Fast Flow 层析柱纯化，流动相为氯化钠溶液，监测波长为280 nm，收集V0附近洗脱液，获得Hib多糖蛋白结合物。试验重复2次。获得3 批（34-20123038、34-20123041、34-20123044）Hib 多糖蛋白结合物，按照《中国药典》三部（2020版）［23］要求进行相关检测。

1.6核磁方法 参考QIN等［16］方法进行1H-NMR、31PNMR扫描；13C-NMR、1H-1H COSY、1H-13C HSQC、HMBC的参数设置见表1。

表1 NMR参数设置Tab.1 NMR parameter setting

2 结果

2.1Hib精制多糖的鉴定Hib精制多糖的各项检查结果均符合标准要求，且3批精制多糖检测结果基本一致，见表2。表明Hib精制多糖的制备工艺稳定性良好。

表2 Hib精制多糖鉴定结果Tab.2 Identification results of Hib capsular polysaccharides

3批Hib 精制多糖的1H-NMR、13C-NMR、31P-NMR谱图具有良好的一致性，见图2。表明3 批Hib 精制多糖品质良好且稳定，精制多糖制备工艺稳定。

图2 3批Hib精制多糖的NMR谱图Fig.2 NMR spectroscopy of three batches of Hib capsular polysaccharides

3批精制多糖的NMR谱图均具有良好的一致性，因此选择34-20011001 批精制多糖作为研究对象，其1H-NMR报告：δ=5.04、4.59、4.23、4.16、4.16、4.08、3.99 ～3.90、3.88 ～3.82、3.75、3.73 ～3.64、3.61、2.20、1.15 ppm，13C-NMR 报告：δ = 106.64、81.90、74.25、73.70、73.67、71.33、70.88、70.05、68.55、66.68、62.26、57.41、16.79 ppm，31P-NMR报告：δ=0.17 ppm。根据PRP的化学结构结合Hib精制多糖的1H-13C HSQC、1H-1H COSY 谱图分析，可知1H-NMR 中3.61 ppm 附近为乙醇的亚甲基（-CH2）中H 信号，2.20 ppm 附近为丙酮的甲基（-CH3）中H 信号，1.15 ppm 附近为乙醇的甲基（-CH3）中H信号，其余均为Hib荚膜多糖相关H 信号；13C-NMR 图谱中57.41 ppm 附近为乙醇的亚甲基（-CH2）中C 信号，16.79 ppm 附近为乙醇的甲基（-CH3）中C 信号，其余均为Hib 荚膜多糖相关C 信号；31P-NMR在0.17 ppm附近有磷酸酯中P信号。在1HNMR、13C-NMR、31P-NMR、1H-13C HSQC、1H-1H COSY谱图中，将每个峰进行归属。见图3。

图3 Hib荚膜多糖的NMR谱图Fig.3 NMR spectroscopy of Hib capsular polysaccharides

2.2Hib多糖衍生物的鉴定 Hib多糖衍生物各项检测结果均符合标准要求，且3 批多糖衍生物检测结果一致，见表3。表明Hib 多糖衍生物的制备工艺稳定性良好。

表3 多糖衍生物的鉴定结果Tab.3 Identification results of polysaccharide derivatives

3 批Hib 多糖衍生物的1H-NMR、13C-NMR、31PNMR 谱图具有良好的一致性，见图4。表明3 批Hib多糖衍生物品质良好且稳定，多糖衍生物的制备工艺稳定。

图4 3批Hib多糖衍生物的NMR谱图Fig.4 NMR spectroscopy of three batches of Hib polysaccharide derivatives

3 批Hib 多糖衍生物的NMR 谱图均具有良好的一致性，因此选择34-20123038 批多糖衍生物作为研究对象，在其1H-NMR 谱图1.60、2.26 ppm 附近，发现与ADH 相关的H 信号；在13C-NMR 谱图24.5、33.28、175.3 ppm 附近，发现ADH 的C 信号；同时在1H-13C HSQC、1H-1H COSY、HMBC 谱图中，均发现了与ADH 相关的信号。见图5。表明Hib 多糖衍生物已连接ADH。

图5 Hib多糖衍生物的NMR谱图Fig.5 NMR spectroscopy of Hib polysaccharide derivatives

2.3Hib多糖蛋白结合物的鉴定 Hib多糖蛋白结合物各项检测结果均符合标准要求，且3 批多糖蛋白结合物检测结果一致，见表4。表明Hib 多糖蛋白结合物的制备工艺稳定性良好。

表4 多糖蛋白结合物的鉴定结果Tab.4 Identification results of protein-conjugated polysaccharides

3 批Hib 多糖蛋白结合物的1H-NMR、13C-NMR、31P-NMR 谱图具有良好的一致性，见图6。表明3 批Hib多糖蛋白结合物品质良好且稳定，多糖蛋白结合物的制备工艺稳定。

图6 3批Hib多糖蛋白结合物NMR谱图Fig.6 NMR spectroscopy of three batches of protein-conjugated polysaccharides

3 批Hib 多糖蛋白结合物NMR 谱图均具有良好的一致性，因此选择34-20123038批多糖蛋白结合物作为研究对象，在其1H-NMR谱图0.75 ～3.0 ppm处，有相应H信号，有别于Hib精制多糖和多糖衍生物1HNMR谱图，推测为ADH和蛋白质上的相关H信号；在13C-NMR谱图24.5、33.28、175.3 ppm附近，ADH相关C信号不明显，可能是连接上载体蛋白后，ADH 相对含量较低导致未能体现在谱图中；同时在1H-13C HSQC、1H-1H COSY 谱图，发现与Hib 精制多糖相似的信号，表明Hib多糖已连接上了蛋白质。见图7。

图7 Hib多糖蛋白结合物的NMR谱图Fig.7 NMR spectroscopy of Hib protein-conjugated polysaccharides

2.4PRP 结构的变化情况 为探讨PRP 在疫苗制备全生命周期中结构的变化情况，将Hib 精制多糖、多糖衍生物、多糖蛋白结合物的1H-NMR、13C-NMR、31PNMR 谱图分别进行叠加对比，可以看出除乙醇、丙酮、ADH相关信号峰的差异外，与PRP结构相关的信号峰基本一致，见图8。表明PRP 结构在Hib 精制多糖、多糖衍生物、多糖蛋白结合物中的谱图均未发生明显变化。

图8 Hib精制多糖、多糖衍生物、多糖蛋白结合物的谱图对比图Fig.8 Comparison of spectroscopy of Hib capsular polysaccharides，derivatives and protein-conjugated polysaccharides

3 讨论

Hib 荚膜多糖是由多个聚核糖基核糖醇磷酸酯重复单元组成，是Hib 结合疫苗中的免疫原［25］。结构是多糖活性的基础［26］，研究多糖结构的变化情况有重要意义。Hib 结合疫苗制备过程中Hib 荚膜多糖经过化学反应（活化、衍生），再与载体蛋白进行偶联，该过程中涉及剧烈的化学反应，Hib PRP 的结构是否发生变化是值得探讨的问题。本研究依托Hib PRP 的基本结构，利用核磁谱图进行解析，在1HNMR、13C-NMR、31P-NMR 谱图中，将Hib PRP 基本单元中的H、C、P 一一归属，并与已报道的Hib 多糖1HNMR 谱图［27］经对比基本一致。Hib 荚膜多糖的1HNMR、13C-NMR 谱图中具有乙醇和丙酮相关信号，表明Hib 精制多糖中残留一定的乙醇和丙酮，但在Hib多糖衍生物和多糖蛋白结合物的1H-NMR、13C-NMR谱图中并未发现与乙醇和丙酮相关信号，表明后续工艺可显著降低乙醇和丙酮的残留水平。Hib 多糖衍生物的1H-NMR、13C-NMR 谱图可明显看出ADH 相关信号，表明已将ADH 连接至Hib 多糖上。而Hib多糖蛋白结合物1H-NMR 谱图中的0.75 ～3.0 ppm处具有与蛋白相关的H 信号，但不能清晰归属；13CNMR 谱图ADH 相关信号峰也未能在谱图中很好体现，均与Hib 多糖衍生物连接上蛋白载体后，导致多糖和ADH相对浓度较低相关。

本研究通过NMR 技术研究Hib 荚膜多糖、多糖衍生物、结合物的结构，结果显示，Hib荚膜多糖到多糖衍生物再到结合物，其基本结构并未发生变化，表明作为Hib 结合疫苗主要抗原的PRP 结构，在疫苗制备的全生命周期内，具有良好的稳定性，即Hib 结合疫苗主要抗原基本结构在疫苗制备周期内具有良好的稳定性。