乳铁蛋白在临床领域应用的研究进展

马小梅，彭乔烽 综述，张海霞，马忠仁 审校

1.西北民族大学生物医学研究中心生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃兰州 730030；

2.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 730030

乳铁蛋白（lactoferrin，LF）是乳液中的一种重要活性物质，属于转铁蛋白超家族，是一种相对分子质量约80 000，约由700个氨基酸组成的哺乳动物非血红素阳离子蛋白，呈对称双叶结构，其独特的结构主要用于控制铁离子的结合和释放。LF等电点（pI）约为8.5，在机体正常pH值下呈正电荷，使其能够通过静电作用包覆在脂质体上［1］。LF在生物体内分布极为广泛，在免疫调节、抗菌、抗肿瘤、抗炎和抗氧化等方面发挥重要作用［2］。有文献报道，LF 能够刺激免疫系统抵抗致病性抗原的入侵及其损伤，同时也能防止因免疫系统紊乱而对宿主产生伤害［3］。本研究就LF 在免疫调节、抗肿瘤、调节发胖机制、抗菌、抗阿兹海默症（Alzheimer disease，AD）及骨再生机制等方面的临床作用的研究作一综述，为后续LF 的临床应用及研究提供方向。

1 LF的结构、功能及其分布

LF 呈对称双叶结构，即N 和C 叶，其中每个叶包括2个结构域（N1、N2和C1、C2）和1个铁结合位点［4］。使用Swissmodel 对GenBank 中登录的序列号为M8-3202.1（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／nuccore／M8-3202.1／）的人LF 全cDNA 进行三维结构分析，在包含非血红素铁结合位点的叶裂隙内，每个叶在CO32-辅助下能够结合1 个Fe3+，同时可与Cu2+、Mn2+和Zn2+低亲和力结合［5］。LF 对铁离子亲和力非常高，不同于血清转铁蛋白（transferrin，TF），TF 会在pH 5.5 时丢失铁离子，而LF 在pH 3.5 时依然紧密结合铁离子，正常生理条件下LF 对铁离子结合常数为1 020，表明它们具有类似封存铁离子的能力。同时，不同于TF的转运，LF可掠夺微生物中的铁离子［6］。

LF 具有很强的生物学活性，除了能够结合和调节体内分泌物中的铁离子外，同时具有抗癌、抗菌、抗病毒、抗氧化、参与免疫调节等诸多功能［7］。近年的研究显示，LF 在严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2）感染中具有药物治疗价值。LF 的研究与开发在医药学、生物制品学、饲料添加等领域具有重要的应用潜力［8］。

不同来源的LF 具有高度的同源性，但大部分由黏膜上皮细胞分泌产生［9］。在哺乳动物体液中，如乳液、眼泪、唾液和阴道分泌液中均有表达，其中乳液含量最丰富，人初乳中LF的浓度为1 ～8 g／L［10］。

2 LF的免疫调节作用

LF 由嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和中性粒细胞对机体出现感染时作出反应而产生［11］。总白细胞数1／2以上的中性粒细胞均表达LF 并将其储存在胞浆中的次级颗粒中，被激活的内皮细胞黏附中性粒细胞后，将中性粒细胞激活，随后在血液中释放LF，尤其在炎症组织中，其浓度可升至200 mg／L（正常情况下约1 mg／L）［12］。研究发现，LF 可降低抑制细胞比例，增加巨噬细胞和树突状细胞比例，促进抑制细胞向巨噬细胞和树突状细胞分化，而LF 对T 细胞的增殖则无直接影响，表明LF 对免疫抑制功能的影响是通过抑制细胞介导的［13］。

LF 作为先天免疫的关键分子，在炎症过程中起主要作用。LF 能增强细胞毒性免疫及阻断一些致瘤性炎症介质的受体，因此可作为标准抗癌疗法的候选佐剂［14］。LF 已被证明可增强适应性免疫反应，并可作为一种有效的抗炎剂［15］。即使相关分子机制仍存在异议，但已有研究阐明，LF 可能通过调节糖蛋白的基因表达从而发挥其抗炎活性机制［16］。李欣等［17］研究发现，LF 可改善慢性压迫性损伤（chronic constriction of sciatic nerve injury，CCI）模型大鼠的疼痛行为学表现，并通过下调炎性细胞因子IL-6和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平抑制炎性反应，从而发挥镇痛作用。

犊牛经大肠埃希菌K99 攻毒后，在饲粮中添加LF，发现LF 具有促进肠道健康、降低腹泻、提高抗氧化能力的作用［18］。ESMAEILI 等［19］将哈维弧菌感染黄鳍金枪鱼，同时向饲料中添加一定量LF，发现投喂含LF 饲料的治疗组，能改善黄鳍金枪鱼的生长性能，提高其自身免疫能力及抗哈维弧菌活性，从而提高存活率。同时研究发现，黄鳍金枪鱼血清总蛋白和总补体活性（CH50）与饲料中添加LF成正比。

3 LF的抗肿瘤机制

据报道，人乳铁蛋白（human lactoferrin，hLF）可显著增加自然杀伤（natural killer，NK）细胞介导的对乳腺癌和结肠癌细胞系的细胞毒性［20］。NK 细胞或靶细胞经hLF 预处理，可分别增强NK 细胞毒性及使靶细胞被裂解。同样，在表达hLF 的宫颈癌鼠模型中，hLF 处理组肿瘤生长减缓与外周血中NK 细胞活性诱导及CD4+、CD8+T淋巴细胞增加有关［21］。经hLF 处理的小鼠血清中IFNγ、IL-2 和TNF-α 上调，血清IL-4和癌组织血管内皮生长因子下调［22］。体外重组人乳铁蛋白TNF-α 介导的肿瘤增殖抑制与NF-κB 信号上调，以及促炎和促转移细胞因子，包括IL-8、IL-6、粒细胞、巨噬细胞集落刺激因子和TNF-α下调有关［23］。

LF 通过抑制VEGFR2／VEGFA／PI3K／Akt／ERK1／2 通路有效抑制人结肠癌细胞HT29 肿瘤生长，且LF 的抗肿瘤活性对热处理有温度依赖性，LF单独或联合热处理（50、70 ℃）可显著抑制细胞增殖、迁移和侵袭，而热处理（100 ℃）对上述参数无明显影响［24］。ZHANG等［25］研究发现，铁饱和型LF（Holo-LF）具有催化H2O2转化为O2的能力，从而缓解肿瘤的缺氧微环境；光声成像进一步证实了LF-Liposome-Dox纳米复合材料存在时氧的大量生成。在此基础上，以LF-Liposome-Dox 作为治疗剂进行体内联合化疗，取得了良好的肿瘤治疗效果。进一步研究发现，Holo-LF可诱导乳腺癌细胞系MDA-MB-23铁下降，促进辐射对缺氧性MDA-MB-231 细胞的损伤，使MDA-MB-231细胞对放疗敏感性增强［26］。

4 LF对发胖的调节机制

20 世纪90 年代早期，就有关于LF 对发胖发病机制影响的相关论述，VANDIJK 等［27］描述LF可影响乳糜微粒残体的清除，也可通过乙酰化和铜氧化的低密度脂蛋白［（low-density lipoprotein，LDL），浓度介于1.025 ～1.055 g／mL 之间］介导巨噬细胞中胆固醇积累。随后研究表明，LF 影响胆汁酸的循环，结合脂蛋白受体刺激脂蛋白与脂肪分解［28］；在成熟脂肪细胞中，LF 影响蛋白激酶A 活性、激素敏感脂肪酶、脂滴包被蛋白和环AMP 敏感转录因子（REB-环AMP 反应元件结合蛋白）的磷酸化以及脂肪细胞中的脂肪分解和脂肪酸氧化效率［29］。

VASILYEV等［30］通过表面等离子体共振和ELISA技术得出由髓过氧化物酶修饰的低密度脂蛋白（myeloperoxidase-modified LDL，Mox-LDL）与LF 相互作用强烈，随着LDL 氧化修饰程度的增加，Mox-LDL 对LF 的亲和力增加，高浓度Mox-LDL 下，LF 可抑制巨噬细胞中胆固醇积累，由此证明LF 可作为抗动脉粥样硬化药物。研究表明，LF 抑制了脂肪生成酶中凋亡相关因子（recombinant factor related apoptosis，FAS）、固醇调节元件结合蛋白-1（sterol regulatory elementbinding proteins-1，SREBP-1）、乙酰CoA羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）蛋白的表达，上调了脂肪甘油三酯脂肪酶（adipose triacylglyceride lipase，ATGL）的表达从而减少脂肪生成，并增加了肝脏的脂肪分解速率以改善脂质代谢［31］。用LF 治疗高脂饮食（high-fat diet，HFD）诱导的肥胖研究表明，LF可减轻肝脏脂质堆积，改善循环脂质状况和调节葡萄糖摄入量的能力，提高p-AMPK／AMPK 值，从而调节细胞能量稳态，证实LF 可预防HFD 诱导的肥胖并改善脂质代谢［31-33］。

5 LF的抗菌机制

LF 具有的铁清除能力使其直接参与抗菌和抗病毒防御的第一线，LF 能抑制甚至协助杀死多种微生物，具有明显抗感染、抗氧化和抗炎症效果［7］。LF的抗菌作用是由于LF水解后会释放出Lfcin B（lactoferricin B），而Lfcin B 形成了两亲性的B 带结构，并暴露正电荷，与细菌细胞膜结合。LF 与细菌脂多糖形成强复合物，在革兰阴性菌外膜上形成1 个洞，从而杀死病原体。同时，LF 对铁离子的螯合和结合阻断了许多病原体生长和繁殖所需的铁［34］。研究表明，LF、铁和细菌之间的相互作用可能比最初想象的要复杂［35］。

BELLAMY 等［35］研究发现，通过猪胃蛋白酶水解牛乳铁蛋白（bovine lactoferrin，bLF）产生了一种水解产物，该水解产物含有一种比完整蛋白质更具抗菌活性的阳离子肽，称为牛乳铁蛋白肽（bovine lactoferricin，bLfcin），其中基于bLfcin提出的杀菌活性可分为膜不稳定和由于其铁螯合特性造成的环境铁损耗两种机制。bLF 由于具有两亲性N-末端结构域、高等电点、高阳离子净电荷和脂多糖结合结构域等特性，使其能够破坏细菌膜［36］。PADRAO 等［37］研究证实，bLF 能够渗透无毒的细菌纳米纤维素基质并执行其杀菌作用。

面对微生物威胁，中性粒细胞通过排泄胞外陷阱网（neutrophil extracellular traps，NETs）的方式来释放抗菌素，这些陷阱网主要由一些抗菌剂组成，包括核染色质、组蛋白和LF 等抗菌蛋白［10］，其中无乳链球菌能诱导中性粒细胞排泄NETs，这些陷阱富含LF［38］。小鼠尿路感染（urinary tract infection，UTI）模型中，对其单次膀胱内注射hLF 可显著降低膀胱细菌负载数和中性粒细胞浸润，减少尿路致病性大肠埃希菌在上皮细胞的黏附，增强中性粒细胞的抗菌功能［39］。

6 LF对AD、帕金森病的临床作用

LF 在人脑中的存在已被证实与衰老有关，特别是神经退行性疾病，如AD［40］。LF 在脑内少量表达，但可通过受体介导的胞吞作用以铁结合或无铁形式穿过血脑屏障，并协助纳米颗粒药物传递［41］。

LF 治疗后的AD 患者体内氧化应激标志物水平显著降低，这与研究认为的LF 通过清除NO、防止膜脂过氧化产物丙二醛（malondialdehyde，MDA）的积累、维持正常的谷胱甘肽含量从而抗氧化的作用相关［42］。唾液腺中的LF 在AD 诊断中具有较好的作用。唾液中的LF 可检测出AD 的早期症状和患病情况，与额颞叶痴呆诊断标准相比，敏感性达87%以上，特异性达91%以上，这为AD 提供了一种新的非侵入性和成本效益高的生物标志物［43］。

利用含有脑靶向配体LF 并负载芍药苷（paeoniflorin，PAE）的黑磷纳米片（black phosphorus，BP）设计制备的能够高效穿越血脑屏障的新型LF-BPPAE 给药纳米平台表现出优异的近红外响应电压互感器（photothermal，PT）效果。在光热效应激活LF-BPPAE 后，这些LF-BP-PAE 颗粒能够穿透血脑屏障，具有良好的生物相容性和抗帕金森病治疗效果，能够有效地靶向治疗帕金森病［44］。患有轻度认知障碍和散发性AD 的患者唾液LF 水平降低，对携带人类AD基因突变的转基因小鼠的唾液LF 调节和功能的研究可证实这种早期的影响。

7 LF对骨再生作用的机制

LF 可促进成骨细胞增殖分化，抑制破骨细胞形成［45］。INUBUSHI等［46］通过分析Smads和有丝分裂激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）信号分子的表达，对小鼠颅骨进行离体器官培养，以评估bLF对骨再生的影响。结果表明，bLF通过激活Smad2／3 和p38 MAPK 促进间充质干细胞向成骨细胞分化，从而提高Runx2 的转录活性，证实bLF 是一种强有力的成骨因子。bLF 治疗不仅加速了由成骨细胞增殖因子（osteoblast proliferation factor，OPF）介导的早期骨生长，还缩短了ORF 愈合过程中的重塑时间［47］。谢银丹等［48］研究表明，LF 能够促进骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的增殖，使BMSCs 向成骨方向分化，更好地促进新骨形成，且对三唑酮所诱导的BMSCs 损伤具有修复作用。通过胃蛋白酶消化LF，从水解物中鉴定出1种具有成骨活性的LFP-C肽段，该肽段可促进小鼠细胞系MC3T3-E1增殖，表明LFP-C 可促进成骨细胞的增殖和分化，这可能是LF 发挥成骨作用的主要作用区域［49］。LI等［50］的研究证明，与对照组相比，口服LF（500 mg／g）可使兔的骨再生性增强84%。然而，口服LF 通常需要大量给药，并会导致副作用，如非预期的组织骨化［51］。

骨再生领域的研究提出，可通过物理和化学固定技术，在纳米纤维的表面引入骨诱导分子，如成骨肽或蛋白质［52］；将固定有骨形态发生蛋白2（乳酸-羟基乙酸）的聚纳米纤维移植至大鼠的缺损临界股骨中时，与未修饰的纤维相比，其体内骨再生增强了2倍［53］。PAL 等［54］发现了1 种LF 模拟肽LP 2，由hLF N 叶N-末端的18 个残基片段组成，比全长蛋白能够更有效地促进成骨细胞分化以及骨保护素（抗破骨细胞生成因子）的成骨作用，其效果强于特立帕肽，证明LP 2是一种可通过全身给药方式治疗难以愈合的骨折的新型肽。

8 小结及展望

LF在免疫调节、抗肿瘤、抗菌、发胖发病、AD、骨再生等领域均具有重要作用，对研究各类疾病的发生、发展意义重大［3］。随着对LF的深入研究，其功能机制逐渐清晰。LF 广泛的生理功能与其对哺乳动物细胞上各种异质受体的活性有关［28］。研究证明，铁结合的LF 可通过受体介导的信号通路，调节细胞因子穿透血脑屏障和肾小球基底膜的渗透，使LF 可在体内任何区域直接或间接（如修饰载体）作用于肿瘤［25］，使LF 在抑制肿瘤生长与辅助化疗等方面发挥了重要作用。

目前虽有几种抗菌抗炎药可用于治疗临床感染，但对耐药微生物（尤其是抗生素）的滥用和现有化合物疗效有限性的担忧日益加剧［14］。因此，急需寻找和开发更有效的药物，从而克服耐药性问题，也可在与其他治疗方法结合时发挥协同作用［40］。由于可用的骨移植选择的内在局限性，以及超过身体再生能力的骨缺损发生率不断上升，寻找改进骨移植材料的需求强烈，LF 已被证实为一种成骨因子，其介导的促成骨应用极好地缓解了这种情况［54］。

LF 在免疫调节上的作用机制已经较为成熟，因此近年来其在肿瘤、AD 和骨再生的治疗中发挥的作用越来越受到关注，并且是常用的抗癌药物配体与运载介质。尽管LF 在抗菌、骨再生等方面的作用效果已经达到预期，可作为良好的抗感染和骨损伤治疗药物，但LF 在发胖发病上的作用机制尚需进行更深入的研究。