5个种属血白蛋白多克隆抗体的制备及其效果评价

张建敏，周长明，李潇，胡宇驰，王铁松，赵璇

北京市药品检验研究院国家药品监督管理局仿制药研究与评价重点实验室国家药品监督管理局创新药安全研究与评价重点实验室，北京 102206

人血白蛋白（human serum albumin，HSA）是一种从健康人血中分离纯化制成的血液制品［1］，是由585个氨基酸组成的单链非糖基化蛋白，含有17 个二硫键，呈球状结构，相对分子质量约66 000，等电点为4.7～4.9。HSA常用于急救、感染、凝血障碍等危重患者的治疗，SARS-CoV-2疫情流行期间推荐在COVID-19的诊疗方案中与静注人免疫球蛋白联合使用［2-4］。HSA的分离纯化方法主要包括低温乙醇沉淀法、层析法及两种方法结合［5］，目前，我国已上市的HSA产品均采用低温乙醇沉淀法生产。目前，HSA 的需求量极大［6-10］，供需矛盾突出［11］，且批签发管理办法规定血液制品均需法定检验机构进行检验及摘要审核，取得批签发证书后才能上市［12］，申报数量大且呈逐年上升趋势。近年，国家药品监督管理局为加快紧急使用血液制品上市，对其实施同步批签发政策，仅2020年上半年，HSA同比增长43.15%，这对企业质检放行和检验机构的批签发时限均是严峻的挑战［11］。

《中国药典》三部（2020版）及进口注册标准均规定，采用免疫双扩散法对HSA制品进行鉴别检查［13］。该方法需使用中国食品药品检定研究院提供的抗血清鉴别试剂盒进行检测。由于HSA检测的需求量极大，抗血清鉴别试剂盒供应出现严重不足，无法满足日益增长的检测需求，另外，HSA 抗血清纯度及特异性较低，较难应用于HSA 抗血清快检方法的研发。本研究通过生物信息学方法筛选出人、牛、羊、猪、马血白蛋白多肽抗原区域的特异性非同源表位，人工合成多肽，经免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体［14］，并检测其效价及特异性，以期为HSA 快速检验试剂盒的研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1样品 HSA 购自山西康宝生物制品股份有限公司。

1.2主要试剂及仪器 钥孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）、完全福氏佐剂（complete Freund′s adjuvant，CFA）、不完全福氏佐剂（incomplete Freund′s adjuvant，IFA）及氨基黑10B 均购自美国Sigma 公司；预染蛋白质marker购自美国Themo scientific公司；HRP标记的羊抗兔IgG（H+L）购自北京中杉金桥生物技术有限公司；新生牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司；Protein A 层析柱购自武汉金斯瑞生物科技有限公司；抗血浆鉴别试剂盒购自中国食品药品检定研究院；PVDF 膜（0.45 µm）购自德国Merck公司；Synergy Mix 酶标仪购自美国BioTek 公司；高效液相色谱仪购自日本岛津公司。

1.3实验动物 普通级新西兰大白兔，雄性，9 周龄，体质量约2 kg，购自曲周县超琦牧业有限公司，动物合格证号为：SYXK（京）2021-0067。本实验对兔的所有处理均以科研为目的进行养殖和使用，按照动物伦理相关规定进行。

1.45个种属血白蛋白多肽抗原设计及合成 在PubMed数据库检索人、牛、羊、猪、马血白蛋白基因编码的氨基酸序列，应用DNAstar 7.1 软件进行生物信息学分析，筛选出一段包含14个氨基酸的多肽序列［4］，并采用固相化学法合成，高效液相色谱仪测定纯度。将合成的多肽分别与载体蛋白KLH 进行偶联，得到用于制备其多克隆抗体的5 个种属血白蛋白多肽抗原，均由合肥国肽生物科技有限公司制备。

1.55 个种属血白蛋白多克隆抗体的制备 分别取不同种属血白蛋白多肽抗原约2 mg，用2 mL PBS 溶解，取抗原溶液0.5 mL，与CFA 按1∶1 的体积分数进行充分乳化，用相同方法将抗原与IFA 进行乳化。将5 种CFA 乳化抗原经新西兰大白兔背部皮下多点免疫，200µg／（400µL·只），2 只／种；初次免疫后14 d，用IFA 乳化抗原进行加强免疫，免疫途径同初次免疫，剂量减半；加强免疫后14 d，用IFA乳化抗原经新西兰大白兔背部肌内多点免疫。末次免疫后7 d，经耳静脉采血，分离血清，通过Protein A 亲和层析柱纯化后，获得5个种属血白蛋白的多克隆抗体。

1.65个种属血白蛋白多克隆抗体效价的检测 采用ELISA法。5个种属血白蛋白多肽抗原均用PBS稀释为4µg／mL，分别加入96孔板，100µL／孔，4 ℃包被过夜；用含3%脱脂奶粉的PBST于37 ℃封闭1 h；PBS洗涤5次，分别加入5种多克隆抗体（1∶10 000～1∶160 000稀释），同时设阴性对照孔（未免疫的新西兰大白兔血清）和空白对照孔（PBS），100µL／孔，37 ℃孵育1 h；PBS洗涤5次，加入HRP标记的羊抗兔IgG（H+L）（1∶1 500稀释），100µL／孔，37 ℃孵育1 h；PBS洗涤5次，加入底物显色剂，100µL／孔，37 ℃孵育15 min；加入终止液，50µL／孔，用酶标仪检测A450。样品孔A450≥阴性对照孔A450的2倍，且与阴性对照孔A450之差＞0.2时的最高稀释倍数作为抗体效价。

1.75个种属血白蛋白多克隆抗体特异性的检测 采用Western blot法。分别取人、牛、羊、猪、马血白蛋白（抗血浆鉴别试剂盒）25µL，经15%SDS-PAGE 分离后，转移至PVDF 膜上，用含5%新生牛血清于4 ℃封闭过夜；分别加入5 个种属多克隆抗体（均1∶2 000 稀释），室温孵育2 h；PBST 洗涤3 次，每次5 min，加入HRP 标记的羊抗兔IgG（H + L）（1∶500 稀释），室温孵育2 h；PBST洗涤3次，每次5 min；ECL法显色。

1.85个种属血白蛋白多克隆抗体的应用 取人、牛、羊、猪、马血白蛋白（抗血浆鉴别试剂盒）1 mL，分别加入3 mL生理盐水，摇匀；取1.5%琼脂糖溶液50 mL，倒置（10×20）cm2玻璃板上，冷却后打7个孔，共制备5块板，每块板中间孔分别加入5 种属血白蛋白多克隆抗体，周围5 孔均加入HSA 稀释液，剩余1 孔分别加入HSA样品及牛、羊、猪、马血白蛋白稀释液，20µL／孔，37 ℃孵育24 h；用0.9%生理盐水充分浸泡琼脂糖凝胶板，除去未结合蛋白质，置0.5%氨基黑10B 溶液中染色5 min，再用脱色液脱色至背景无色，沉淀线呈清晰蓝色为止。

1.9数据采集及分析 应用Excel 2010 软件进行数据采集及分析，Cytoscape软件作图。

2 结果

2.15 个种属血白蛋白多肽抗原合成及纯度 人工合成的人、牛、羊、猪、马血白蛋白多肽片段的14 个氨基酸残基序列见表1，高效液相色谱法鉴定其纯度达91%以上，满足用于动物免疫的要求。

表1 人、牛、羊、猪、马血白蛋白氨基酸序列Tab.1 Amino acid sequences of serum albumin of human，cattle，sheep，pig and horse

2.25个种属血白蛋白多克隆抗体的效价 人、牛、羊、猪、马血白蛋白多克隆抗体的效价均为1∶160 000，见表2。

表2 ELISA 法检测5个种属血白蛋白多克隆抗体效价（1∶x）Tab.2 Detection of titers of polyclonal antibody of five species of serum albumin by ELISA（1∶x）

2.35个种属血白蛋白多克隆抗体的特异性 人、牛、羊、猪、马血白蛋白多克隆抗体均可与相应种属血白蛋白发生特异性结合，且于相对分子质量约66 000处可见特异性结合条带，见图1。

图1 Western blot法检测多克隆抗体的特异性Fig. 1 Detection of specificity of polyclonal antibodies by Western blot

2.45个种属血白蛋白多克隆抗体的应用 HSA仅与HSA 多克隆抗体产生沉淀线，与马、牛、猪、羊血白蛋白多克隆抗体均不产生沉淀线，见图2。

图2 5个种属血白蛋白多克隆抗体用于免疫双扩散法检测HSA的效果Fig.2 Effect of polyclonal antibodies against serum albumin of 5 species on detection of HSA by immuno-double-diffusion method

3 讨论

HSA 的鉴别是采用免疫双扩散法，其原理是于琼脂糖凝胶上打孔，在相邻两孔内分别加入抗原、抗体，若其相互结合则会形成免疫复合物沉淀线，以此对供试品的特异性进行鉴别检查［13］。目前，用于HSA 鉴别的试剂盒均由中国食品药品检定研究院提供，试剂盒中分别含有1.0 mL／支的人、猪、马、牛、羊血白蛋白。由于HSA 申报批数逐年升高，审批量增速加快，建立高通量、大规模、快速、准确检测方法已成为亟需解决的关键问题［15-16］。本研究通过生物信息学方法预测并人工合成耦联KLH的人、牛、羊、猪、马血白蛋白多肽片段，并以其为抗原，与佐剂混合后免疫大白兔，制备相应的多克隆抗体［17-18］。该方法通过刺激网状内皮系统，增加免疫活性细胞，促进T细胞与B 细胞的相互作用，进而增强抗体的产生，可实现高通量制备抗体。与传统原核表达目的蛋白制备的抗原比较，人工合成多肽的纯度更高，操作更简便，且获得的抗体特异性更强，灵敏度更高，耗时更短［19］。Western blot特异性检测及免疫双扩散的鉴别试验表明，本研究制备的多个种属多克隆抗体具有良好的特异性，且制备过程简单快速，适合大量生产，可用于HSA鉴别试剂盒的制备。

为提高监管部门打击假冒伪劣HSA 的能力，急需一种快速、简单、高通量的HSA检测方法［15］。本研究制备的多个种属多克隆抗体纯度高、特异性强，用其制备的HSA 鉴别试剂盒也可用于HSA 真伪的快速检测。今后本课题组还将对制备的多克隆抗体进行HRP 及胶体金标记，以期用于HSA 的质量控制和快速鉴别检验工作。