基于网络药理学探讨巴元明治疗慢性肾功能衰竭核心药物的作用机制*

刘施,李成银,高越,陈树和,巴元明,徐玉婷

湖北省中医院,湖北中医院大学附属医院,湖北 武汉 430061

慢性肾功能衰竭(chronic renal failure,CRF)发病机制复杂,涉及肾小球病变、肾小管间质纤维化、脂质代谢异常等多个方面[1]。西医治疗CRF存在一定的局限性,如治疗成本高、替代治疗方案普及程度不足等。相比之下,中医药治疗CRF具有较好的疗效和优势[2-5]。课题组前期基于中医传承辅助平台构建巴元明治疗CRF的医案数据库,采用关联规则Apriori算法和熵聚类分析方法筛选核心药物,包括黄芪、党参、生地黄、山药、山茱萸、茯苓、白茅根、茜草、金樱子、芡实、黄柏、穿山甲。这些核心药物是在清代医家沈金鳌所撰《沈氏尊生书》中的参芪地黄汤基础上加减化裁而来[6],这一方剂具有较好的临床疗效。鉴于中药复方具有多成分、多靶点的特性,这些核心药物治疗CRF的作用机制尚未完全阐明。网络药理学具有整体性、系统性等特征,能够有效阐释中药的作用机制[7],并为研究复杂的中药系统提供新思路[8-9]。本研究拟采用网络药理学方法探讨巴元明治疗CRF核心药物的作用机制,以期为后续的临床和基础研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 核心药物活性成分及作用靶点筛选在中医药整合药理学研究平台(integrative pharmacology-based research platform of traditional Chinese medicine,TCMIP)V2.0数据库[10](http：//www.tcmip.cn/)的“中药材数据库”中建立任务列表,检索黄芪、党参、生地黄、山药、山茱萸、茯苓、白茅根、茜草、金樱子、芡实、黄柏、穿山甲的化学成分。根据结构相似的生物分子化合物具有类似理化性质和生物活性的原理,在TCMIP V2.0检索化合物的二维结构,并将其与美国食品药品监督管理局上市药物进行比对,以Tanimoto系数定义的相似度计量方法对相似性打分,选择相似性≥0.8的药物所对应的靶点作为核心药物的作用靶点。

1.2 CRF相关疾病靶点以“chronic renal failure”“renal failure”作为关键词,在TCMIP V2.0“疾病靶标数据库”中进行检索,构建CRF的疾病靶点数据库。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络构建将核心药物作用靶点与CRF疾病靶点进行匹配,所得靶点即为核心靶点。通过TCMIP V2.0数据库构建核心药物作用靶点与CRF疾病靶点之间的PPI网络。

1.4 “核心药物-活性成分-关键靶点”网络构建通过TCMIP V2.0的“中医药关联网络挖掘”模块,针对核心药物作用靶点与CRF疾病靶点的PPI网络计算拓扑特征值,选取大于“介度(Betweenness)”“紧密度(Closeness)”中位数的靶点作为关键靶点,并构建“核心药物-活性成分-关键靶点”的多维关系网络。

1.5 基因本体(gene ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析采用David v6.7数据库(https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp) 对核心靶点进行GO功能分析和KEGG通路分析,结果按照P值从低到高的顺序进行排序。

2 结果

2.1 核心药物化学成分及作用靶点基于TCMIP V2.0数据库获取12个核心药物的化学成分,其中山茱萸56个、茜草52个、金樱子14个、黄芪27个、黄柏24个、茯苓33个、党参64个、芡实1个、白茅根20个、穿山甲8个、山药45个、地黄12个。

设定相似性≥0.8获取化学成分的作用靶点,其中山茱萸784个、茜草210个、金樱子92个、黄芪399个、黄柏87个、茯苓232个、党参540个、芡实21个、白茅根309个、穿山甲91个、山药898个、生地黄656个。

2.2 CRF疾病靶点基于TCMIP V2.0疾病数据库获取13个CRF相关疾病靶点,包括前列腺素E受体 4(prostaglandin E receptor 4 gene,PTGER4)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)等。

表1 CRF疾病靶点信息

2.3 PPI网络及关键靶点将核心药物作用靶点与CRF疾病靶点进行匹配,得到136个核心靶点,构建“核心药物靶点-疾病靶点”的PPI网络,见图1。筛选大于"Betweenness""Closeness"中位数的靶点,得到62个关键靶点,根据Degree值进行排序后,排名前20位的关键靶点,见表2。

注：圆形代表核心药物作用靶点,方形代表CRF疾病靶点。图1 “核心药物靶点-疾病靶点”PPI网络图

表2 巴元明治疗CRF核心药物的关键靶点(前20位)

2.4 “核心药物-活性成分-关键靶点”多维关系网络利用TCMIP V2.0平台“中医药关联网络挖掘”模块,建立巴元明治疗CRF的“核心药物-活性成分-关键靶点”多维关系网络,结果显示核心药物的68个活性成分直接或间接作用于62个关键靶点,见图2。

2.5 GO功能和KEGG通路富集分析针对136个核心靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析,GO分析以P<0.01为筛选条件,共获得170个功能富集,其中生物过程(biological process,BP)涉及信号转导、凋亡过程负调控、血管收缩、腺苷酸环化酶活性的激活等;细胞成分(cellular component,CC)涉及质膜、突触、线粒体等;分子功能(molecular function,MF)涉及细胞色素C氧化酶活性、磷酸吡哆醛结合、受体活性、药物结合、蛋白结合等,排名前9位的GO分析结果见表3。KEGG通路分析以P<0.05为筛选条件,共获得105个通路富集结果,主要涉及神经活性配体-受体相互作用、环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)信号通路、代谢通路、Ras信号通路、近端小管对钠离子的重吸收等,排名前10位的KEGG结果见图3。

图3 KEGG富集通路图(前10位)

表3 GO功能富集分析(前9位)

3 讨论

慢性肾功能衰竭是多种肾脏疾病晚期的最终结局,其发病机制涉及肾小球病变、肾小管间质纤维化等多个方面[11]。本研究基于TCMIP V2.0数据库探索巴元明治疗CRF核心药物的作用靶点和信号通路,结果表明12味中药含有356个活性成分,主要包括黄酮类化合物、甾体皂苷类及生物碱等,排名前20位的关键靶点主要与调节细胞凋亡、炎症反应、免疫反应、新陈代谢等功能相关,主要分为以下几类：(1)腺苷类(ADCY1、ADCY2、ADCY5、ADORA3、ADORA1、ADRA2A、ADRA2B)：腺苷受体广泛分布于肾脏细胞,不同腺苷受体在肾纤维化中起着特异性作用,慢性肾病患者肾组织间隙腺苷浓度与纤维化程度具有相关性[12-13]。(2)多巴胺类(DRD2、DRD3)：多巴胺D2受体可与抑制型G蛋白耦联,发挥抑制腺苷酸环化酶、调节钙离子和钾通道活性的作用[14-16]。(3)热休克蛋白αA1：热休克蛋白90是一种重要的蛋白伴侣,能激活内皮细胞磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-hydroxykinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)通路,在维护肾小球内皮细胞内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)功能中发挥重要作用[17]。(4)5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)受体(HTR1A、HTR1B、HTR1D、HTR2C)：5-HT及其受体是治疗糖尿病肾病的抗氧化靶点,5-HT受体拮抗剂可通过降低肾小球血小板活性、增加血清脂肪细胞因子水平从而改善肾小球内皮细胞功能,进而减轻糖尿病肾病早期出现的蛋白尿[18-20]。(5)核因子κB(NFKB1、NFKB2)：NF-κB通路与炎症相关,处于激活状态时在肾小球肥大、肾脏纤维化等代谢性疾病中发挥重要作用[21]。(6)其他(TP53、AKT1)：研究发现AKT异常表达或激活参与糖尿病肾病纤维化的病理过程[22-23],沉默TP53基因可抑制AKT信号通路从而干扰肾透明细胞癌的局部浸润和远处转移[24]。

本研究挖掘核心药物治疗CRF的KEGG通路,主要包括4种：(1)cAMP信号通路、环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)-蛋白激酶G(cGMP-dependent protein kinase,PKG)信号通路：cAMP、cGMP常作为肾阴虚模型的指标,参与调节多种物质代谢和生理功能;研究表明近端小管钠重吸收与cGMP-PKG通路、蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)通路激活导致哺乳动物雷帕霉素蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)抑制有关[25];此外,cAMP/PKA信号通路的激活与肾纤维化有关[26]。(2)PI3K/AKT/mTOR信号通路：PI3K/AKT信号通路在肾小球系膜细胞增殖、细胞外基质积聚等病理过程中发挥作用;当肾脏受损时,肾上皮细胞中mTOR通路激活,引起细胞增生及纤维化,最终导致肾脏囊肿[27-28]。(3)PI3K/AKT/NF-κB信号通路：通过影响肾小球系膜细胞增殖导致间质纤维化;抑制PI3K/AKT信号传递,阻断NF-κB信号通路激活,可改善肾小球纤维化病变。(4)胰岛素抵抗通路：胰岛素抵抗是慢性肾脏病进展的机制之一,研究表明胰岛素可通过调节足细胞血管内皮生长因子在肾脏的表达水平,进而调节肾小球滤过功能[29]。综上所述,巴元明治疗CRF作用机制可能与调节肾脏炎症反应、干扰肾小球内皮细胞损伤、调节近端小管重吸收、抗肾纤维化、调节胰岛素受体结合、减少蛋白尿等有关。

肾小管间质纤维化是肾脏纤维化的标志,也是慢性肾脏疾病进展的重要因素[30]。本研究发现多条通路参与肾纤维化过程,如cAMP/PKA信号通路、PI3K/AKT/mTOR通路、PI3K/AKT/NF-κB信号通路、胰岛素抵抗通路等,他们可通过调控炎症反应和肾小球系膜细胞增殖,改善肾小球纤维化病变。其中,PI3K/AKT/mTOR信号通路在抑制足细胞凋亡中起关键作用[31-32],足细胞是肾小球内阻止蛋白滤出的重要屏障,足细胞数量减少可造成滤过屏障结构损伤,从而导致蛋白尿[33]。此外,高尿酸可激活NF-κB信号通路[34],触发NF-κB下游大量炎症因子合成,导致肾脏炎症反应。因此,巴元明教授治疗CRF的作用机制可能与抑制炎症反应、调节足细胞的生成与凋亡、减少蛋白尿有关。巴元明教授治疗CRF常用黄芪与穿山甲,研究表明黄芪甲苷可干扰PI3K/AKT/mTOR信号通路激活,抑制肾脏纤维化并通过MAPK途径减弱补体膜攻击复合物诱导的足细胞损伤[35];穿山甲可抑制黄嘌呤氧化酶和肾小管上多种尿酸盐相关转运体的活性从而治疗高尿酸血症,同时抑制NF-κB转录和炎症因子合成,从而抑制因高尿酸刺激诱发的肾脏炎症损伤[36]。

综上所述,巴元明治疗CRF的核心药物具有多成分、多靶点、多途径等特点,其可作用于腺苷酸环化酶1、多巴胺D2受体、热休克蛋白αA1等靶点,调控近端小管对钠离子的重吸收、代谢通路、Ras信号通路等通路。本研究初步挖掘出巴元明治疗CRF核心药物的作用靶点和信号通路,为中医药治疗CRF提供了新思路,但研究结果尚需进一步的实验验证。