基于网络药理学探讨固本平喘剂治疗支气管哮喘的作用机制*

鲍鑫宇,周庆伟

1.阜外华中心血管病医院,河南 郑州 450000; 2.河南中医药大学第一附属医院,河南 郑州 450000

支气管哮喘是以慢性气道炎症为主要特征,多由变应原刺激而诱发,多以呼吸困难、喘息、胸闷、咳嗽等为主症,具有可逆性呼气气流受限及气道高反应的异质性疾病。世界哮喘发病率以1.4%～2.1%的速度逐年上升,预计到2025年,全球将新增1亿哮喘患者[1]。2019年我国哮喘流行病学调查显示,总发病率为4.2%,男性高于女性,农村多于城镇,总患者达4 570万[2]。支气管哮喘是临床常见病,多反复发作、缠绵难愈,加重社会经济负担。西医治疗急性发作期哮喘有较好的临床疗效,但停药后容易复发,远期疗效不佳的弊端还没有解决。中医对哮喘的认识历史悠久,中医药辅助治疗往往能缓解西药不良反应、缩减病程、增强免疫、预防复发。有研究发现,固本平喘剂能改善哮喘症状及肺功能,且疗效确切[3]。本研究利用网络药理学方法,利用生信技术发掘固本平喘剂作用机制,为后期实验奠定一定理论基础。

1 资料与方法

1.1 获取固本平喘剂活性成分及靶标在中药系统药理学数据库TCMSP数据库以“防风”为关键词,以口服生物利用度(oralbioavailability,OB)>30%,类药性(drug-likeness,DL)>0.18为条件筛选其活性成分及靶标,利用UniProt蛋白数据库注释靶标;在中药与化学成分数据库以“补骨脂、地龙”为关键词,利用瑞士生物信息研究所(SIB)平台设置药物动力学参数(absorption为high,Druglikeness中的5种规则至少符合3项),获得“补骨脂、地龙”主要活性成分,并利用SwissTargetPrediction在平台中获得其所对应的靶标[4-5]。

1.2 支气管哮喘靶标基因的获取在人类基因组注释数据库Genecards数据库及OMIM数据库中以“Bronchial asthma”为关键词,检索与支气管哮喘相关靶标基因[6-7]。

1.3 固本平喘剂治疗支气管哮喘潜在作用靶点预测通过Venny 2.1绘图工具,将固本平喘剂主要活性成分对应的靶基因与支气管哮喘靶基因相映射,获得固本平喘剂治疗支气管哮喘的关键作用靶基因。

1.4 成分-靶点网络的构建与分析利用Cytoscape 3.6.1构建“成分-靶点”网络。在网络中,节点(node)代表补骨脂、地龙、防风活性成分、关键靶基因,边(edge)代表活性成分与靶基因相互作用关系。

1.5 PPI网络构建筛选与潜在作用靶蛋白之间有相互作用关系的靶蛋白,将1.3筛选出的共同靶标导入String数据平台,将蛋白种类定义为“Homo sapiens”,设置信度>0.9为筛选条件,获取蛋白相互作用关系,将其导入Cytoscape 3.6.1中,并运用其插件“Network Analyze”分析网络拓扑参数,以节点度值越大说明其越重要[8]。

1.6 基因富集分析及其可视化将固本平喘剂与支气管哮喘的共同基因导入功能注释生物信息学分析平台(DAVID)数据库,进行基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析和基因本体(gene ontology,GO)功能富集分析。筛选P<0.001的通路,选取富集基因数最多的前10条通路,并绘制高级气泡图[9]。

1.7 分子对接为了支撑预测的可靠性,进行分子对接,为了验证固本平喘剂活性成分预测靶点的准确性,利用Autodock vina软件使预测靶点与固本平喘剂的核心活性成分进行对接,筛选结合能最低的结构为最优结构[10]。

2 结果

2.1 固本平喘剂活性成分与相应靶点通过对TCMSP数据库和中药与化学成分数据库进行筛选,符合筛选条件的共有53个活性成分,补骨脂18个,地龙17个,防风18个,见表1。

表1 固本平喘剂活性成分

2.2 支气管哮喘潜在靶点预测通过GenCards、OMIM数据库剔除重复后,共收集支气管哮喘潜在靶点2 358个。

2.3 固本平喘剂治疗支气管哮喘潜在作用靶点将固本平喘剂和支气管哮喘靶点进行映射取交集共得到237个交叉靶点,即固本平喘剂治疗支气管哮喘潜在作用靶点,见图1。

图1 固本平喘剂和支气管哮喘靶点韦恩图

2.4 构建“药物-成分-靶点”网络在Cytoscape 3.6.1软件中导入固本平喘剂的活性成分与潜在作用靶点,构建药物-成分-靶点网络,见图2。此网络共包括节点293个,边765条。节点(node)代表固本平喘剂所含中药防风、地龙、补骨脂,其活性成分以及治疗支气管哮喘潜在作用靶点;边(edge)代表其相互作用关系。以degree值排名前10位的活性化合物包括补骨脂双氢黄酮(bavachin)、异补骨脂双氢黄酮(isobavachin)、补骨脂双氢黄酮甲醚(bavachinin)、补骨脂色烯查耳酮(bavachromene)、异补骨脂查耳酮(isobavachalcone)、补骨脂呋喃查耳酮(bakuchalcone)、汉黄芩素(wogonin)、补骨脂酚(bakuchiol)、新补骨脂查耳酮(neobavachalcone)、β-谷甾醇(beta-sitosterol),度值分别为62、62、61、57、57、37、31、28、27、26;以degree值大于二倍均值的靶点为PTGS2、ESR1、ACHE、ESR2、PTGS1、DPP4、ADORA3,表明以上活性成分及靶点在网络中的具有一定的重要性。

注：红色节点为药物,绿色节点为活性成分,黄色节点为靶点。图2 固本平喘剂-活性成分-靶点网络

2.5 蛋白相互作用网络的构建将固本平喘剂可能与支气管哮喘相关的237个靶蛋白导入String数据库中,获取其相互作用关系,利用Cytoscape 3.6.1软件可视化,得到蛋白互作PPI网络,见图3。图中共涉及237个节点、1 540条边,其中,节点越大度值越大,其关系越密切,其在网络中更重要。根据网络拓扑数据进一步分析可知,degree值排名前5位的靶蛋白为PIK3CA、MAPK3、MAPK1、TP53、AKT1。

注：红色节点代表靶蛋白,绿色边代表靶蛋白相互作用,degree越大则节点越大。图3 固本平喘剂核心靶蛋白相互作用网络图

2.6 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析利用DAVID6.8数据库,将固本平喘剂与支气管哮喘相映射的靶点进行GO功能富集分析、KEGG通路富集分析,以“count”排名制作柱状图及高级气泡图。通过GO功能富集分析可知,富集基因数量前10位的生物过程是炎症反应、RNA聚合酶II启动子转录的正调控、ERK1和ERK2级联的正调控、转录DNA模板、RNA聚合酶II启动子转录的负调控、蛋白质自磷酸化、凋亡过程的负调控、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路、肽基丝氨酸磷酸化、调节细胞增殖,见图4。这提示支气管哮喘的发生,涉及多种生物过程,而固本平喘剂可以通过对以上多种生物过程的调节,起到治疗支气管哮喘的作用。KEGG通路富集分析可知,固本平喘剂治疗支气管哮喘的靶标主要与PI3K-Akt信号通路、cAMP信号通路、HTLV-I感染、甲型流感、HIF-1信号通路、TNF信号通路、趋化因子信号通路、FoxO信号通路、Rap1信号通路、MAPK信号通路、Ras信号通路、Toll样受体信号通路、T细胞受体信号通路等通路关系较为密切,见图5。以上结果表明,固本平喘剂可能通过多通路共同起到治疗支气管哮喘的作用。

图4 固本平喘剂靶点的GO(BP-CC-MF)富集分析柱状图

图5 固本平喘剂治疗支气管哮喘靶标的KEGG通路富集气泡图

2.7 分子对接将2.4筛选的14个主要活性成分作为小分子配体,通过Pubchem数据库下载保存为“SDF”格式文件;将2.5下Degree值排名前5的蛋白靶点作为受体,通过PDB数据库下载保存为“PDB”格式文件,利用PyMOL软件去水加氢后将受体及配体保存成“pdbqt”格式文件,利用Autodock Vina进行分子对接,筛选结合能绝对值最高的为最优结构,见图6。结果显示：固本平喘剂活性成分均能与关键靶标稳定结合,其中,4个对接(5.7%)的结合能值<-9.0(结合能力高,构象稳定),44个对接(62.9%)在-7.0～-9.0 之间(结合能力较高),有21个结合(30.0%)在-5.0～-7.0 之间(结合能力一般),有1个(1.4%)>-5.0(结合能力差或不能结合);与PIK3CA结合最好的为isopsoralidin(结合能为-9.9 kcal·mol-1),其次为bavachromene(结合能为-9.2 kcal·mol-1)分子对接模式,见图7、图8。由此可见,固本平喘剂的活性成分和关键靶蛋白的结合能力较好,从侧面初步证明了预测结果的可靠性。

图6 “成分-靶点-通路”网络

图7 固本平喘剂分子对接

3 讨论

哮喘多以发作性咳嗽、胸闷、气喘、甚至呼吸困难,易反复发作为特征,是一种由多种细胞参与的慢性气道炎症性疾病。西医多从缓解气道痉挛和改善气道炎症治疗。元代医家朱丹溪首创“哮喘”病名,明确病机于痰,确立“未发以扶正为主,既发以攻邪为急”的施治要领。后世医家认为“哮必兼喘”,故统称哮喘。哮喘病机多由邪气、饮食、劳倦、情志诱发,以肺、脾、肾气虚为本,痰饮伏肺为标,痰滞气道,痰气相搏,发为本病。针对病机中医治疗多以标本兼治、补虚泻实为主。固本平喘剂是由补骨脂、防风、地龙三药组成,共达补肺健脾、补肾纳气、化痰平喘之功。《本草分经》云：“补骨脂辛、苦,大温,入心包命门,补相火以通君火,暖丹田,壮元阳,能纳气归肾。”《药类法象》云：“防风治风通用。泻肺实,散头目中滞气,除上焦风邪。”《神农本草经》中记载地龙清热定惊、通络、平喘、利尿,多用于肺热哮喘,喉中哮鸣有声者。

固本平喘剂对于急性支气管哮喘治疗效果较好,但其作用机制尚不清晰。网络药理学以全面、联系的思想,科学阐释其治疗哮喘的作用机制。有研究表明,补骨脂双氢黄酮甲醚可以调控GATA-3的水平,抑制Th2细胞因子的产生,对哮喘气道炎症具有抑制作用[11]。异补骨脂查尔酮通过抑制STAT6磷酸化及GATA-3的表达达到抑制白细胞介素(interleukin,IL)-4的表达,减少气道高反应性、嗜酸性粒细胞及气道黏液分泌[12]。汉黄芩素通过抑制STAT6活化,还可通过抑制IgE,肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α和IL-6的产生,抑制MAPK/Akt信号传导,促使中性粒细胞凋亡,减轻过敏性哮喘气道炎症[13-14]。β-谷固醇可能通过抑制细胞反应以及Th2细胞因子合成来抑制 TNF-α、IL-4和IL-5细胞因子增多,达到抗感染、免疫调节作用[15]。新补骨脂异黄酮通过抑制活性氧、活性氮及IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α等的产生起到抗感染作用[16]。补骨脂酚具有抗菌、抗感染、抑制细胞NO生成的作用[17-18]。未见报道的核心成分为补骨脂双氢黄酮(bavachin)、异补骨脂双氢黄酮(isobavachin)、补骨脂色烯查耳酮(bavachromene)、补骨脂呋喃查耳酮(bakuchalcone)、新补骨脂查耳酮(neobavachalcone),可做进一步实验,以验证其治疗支气管哮喘的作用机制。

通过DAVID 6.8数据库,本研究预测了固本平喘剂治疗哮喘的信号通路,包括PI3K-Akt信号通路、cAMP信号通路、HTLV-I感染、甲型流感、HIF-1 信号通路、TNF信号通路、趋化因子信号通路、FoxO信号通路、Rap1信号通路、MAPK信号通路、Ras信号通路、Toll样受体信号通路、T细胞受体信号通路等信号通路。涉及核心靶点最多的PI3K-Akt信号通路可调控细胞生存、增殖及凋亡[19];机体受炎症、细胞因子、生长因子等刺激后,致使PI3K、Akt的活化是气道重塑形成的重要途径[20]。TNF-α通路与儿童哮喘发病机制密切相关,可能通过激活TNF-α通路促使Caspase-3、Caspase-8表达增加诱导哮喘发生[21]。另外,TNF-α 还可诱导多种细胞因子产生,从而加重哮喘,甚至发生气道重建[22]。MAPK信号通路改变免疫、炎性因子、气道上皮细胞引发气道高反应,产生Th1/Th2免疫失衡,诱发哮喘[23]。研究表明,FOXO1具有促炎作用,可上调Th2免疫反应,增加趋化因子、黏液细胞诱发哮喘[24-25]。Toll样受体可能通过PI3K/Akt信号通路对哮喘气道炎症起调控作用[26]。

以上结果表明,固本平喘剂主要作用机制是通过调节PTGS2、ESR1、ACHE、ESR2、PTGS1、DPP4、ADORA3、PIK3CA、MAPK3、MAPK1、TP53、AKT1等核心靶点起到抗感染、调节免疫、抑制气道重塑等发挥治疗支气管哮喘作用。不同信号通路之间有相互作用联系,共同调控人体机能,体现了中药多成分、多靶点、多途径相互联系的作用机制。本研究从网络药理学角度探讨了固本平喘剂治疗支气管哮喘的可能分子机制,使以后的研究者更有针对性,但仍具有一定局限性,有待进一步探究及实验验证。