基于网络药理学和分子对接探讨川牛膝治疗继发性闭经的作用机制*

黄紫薇,罗喜,王希,张伶俐

1.湖南中医药大学,湖南 长沙 410208; 2.湖南中医药大学附属省直中医院,湖南 株洲 412000;3.湖南中医药高等专科学校附属第一医院,湖南省直中医医院,湖南 株洲 412000

继发性闭经(secondary amenorrhea,SA)是指月经初潮后停经超过自身3个月经周期或超过6个月[1]。闭经的发病率约为5%,SA发病率约占闭经的95%[2]。随着生活节奏加快,工作压力增加,SA的发病率呈上升趋势,严重影响女性健康,如低雌激素所致的骨质疏松症和生殖道萎缩,长期雌激素刺激而无孕激素对抗的子宫内膜过度生长甚至子宫内膜癌,青春期无月经所致的精神心理障碍以及婚后不孕等[3-4]。下丘脑-垂体-卵巢-子宫轴的神经内分泌功能失调是SA的主要病因[5],临床上针对相应病变环节采用手术、激素以及全身治疗等方式能取得一定的临床疗效[6]。但长期和周期性用药导致的药物副作用明显和患者依从性差是亟待解决的问题。中医药治疗SA具有辨证论治和整体调节的优势,且具有多成分、多靶点、多途径的治疗特点。

川牛膝(CyathulaeRadix)是苋科植物川牛膝(Cyathulaofficinalis)的干燥块根,主要产于四川省天全县,性善下行(引血下行),功善逐瘀通经,是临床治疗经闭癥瘕的常用药[7]。如《本草经疏》言：“血行则月水自通,血结自散”,本品逐瘀通经,故能“疗妇人月水不通,血结”(《名医别录》)。现代药理学研究发现,川牛膝含有多糖、甾酮类、皂苷、阿魏酸等活性成分,具有调节血液黏稠度、改善微循环等药理作用[8]。其所含的甾酮类化合物为天然植物雌激素,可有效治疗女性生殖内分泌疾病[9]。但目前川牛膝治疗SA的作用机制研究尚且缺乏,对川牛膝药效成分、靶点及通路的相互作用关系尚不清楚。本研究基于网络药理学和分子对接技术探讨川牛膝治疗SA的可能作用机制,为川牛膝的临床应用提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 川牛膝活性成分及作用靶点筛选通过中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)检索川牛膝的活性成分,药物动力学参数设置为口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、类药性(drug likeness,DL)≥0.18,从而筛选川牛膝的活性成分与作用靶点。

1.2 SA疾病靶点获取以“Secondary Amenorrhea”为检索词,通过GeneCards数据库(https：//www.genecards.org/)获取SA相关疾病靶点。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络构建及关键靶点筛选采用R软件获取川牛膝作用靶点与SA疾病靶点的交集靶点,将其作为川牛膝治疗SA的关键靶点,并绘制韦恩图。将关键靶点上传至STRING数据库(https：//www.string-db.org/),设置物种为Homo sapiens,置信度为0.9,隐藏游离节点,得到PPI网络。然后,通过Cytoscape 3.8.2软件的MCODE插件进行聚类分析。

1.4 “药物-活性成分-关键靶点”网络构建及核心靶点筛选将川牛膝活性成分、关键靶点导入Cytoscape 3.8.2软件,从而构建“药物-活性成分-关键靶点”网络。应用Network Analyzer插件对PPI网络进行拓扑分析,以度值(degree)中位数的2倍、介度中心性(between centrality,BC)中位数和紧密中心性(closeness centrality,CC)中位数为条件筛选核心靶点。

1.5 基因本体(gene ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析利用R软件对川牛膝治疗SA的关键靶点进行GO功能富集和KEGG通路富集分析,以P<0.05为筛选条件,取各项结果的前10条数据绘制富集图,并将其作为川牛膝治疗SA的关键通路和功能。

1.6 分子对接通过Pubchem数据库(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获取川牛膝活性成分的小分子结构,将其作为配体蛋白;通过PDB数据库(https：//www.rcsb.org/)获取核心靶点的PDB结构,将其作为受体蛋白;然后,通过AutoDock Tools 1.5.6软件对受体和配体进行去水、加氢等处理,采用Autodock Vina软件进行分子对接。

2 结果

2.1 川牛膝活性成分及作用靶点基于TCMSP数据库初步检索获得川牛膝化学成分41个,根据OB≥30%、DL≥0.18进行筛选,最终获取4个活性成分,见表 1。基于TCMSP数据库获取川牛膝的作用靶点178个,其中槲皮素136个,β-谷甾醇26个,甜菜素15个,红苋甾酮1个。

表1 川牛膝活性成分信息

2.2 川牛膝治疗SA的关键靶点基于GeneCards数据库获取SA相关靶点1 366个,利用R软件绘制川牛膝作用靶点和SA疾病靶点的韦恩图,得到56个交集靶点,将其作为川牛膝治疗SA的关键靶点,见图1。

图1 川牛膝作用靶点与SA相关靶点韦恩图

2.3 PPI网络及川牛膝治疗SA的核心靶点根据活性成分、关键靶点构建“药物-活性成分-关键靶点”网络,见图2。由图可知,川牛膝通过多成分、多靶点发挥治疗作用,活性成分以槲皮素的作用最为显著。将56个关键靶点导入STRING数据库,获取川牛膝治疗SA的PPI网络图,见图3。应用Cytoscape 3.8.2软件的MCODE插件进行聚类分析,获取3个子网络,其中A有5个节点、10条边,得分5.0;B有6个节点、9条边,得分3.6;C有4个节点、5条边,得分3.3,见图4。应用Network Analyzer插件进行拓扑分析,根据“Betweenness Centrality”“Closeness Centrality”“Degree”值筛选得到9个核心靶点,包括丝裂原活化蛋白激酶1(mitogen activated protein kinase 1,MAPK1)、雌激素受体1(estrogen receptor 1,ESR1)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)等,见表2。

图2 “药物-活性成分-关键靶点”网络图

图3 川牛膝治疗SA的PPI网络图

图4 川牛膝治疗SA的PPI聚类分析图

表2 川牛膝治疗SA的核心靶点信息

2.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析利用R软件对56个关键靶点进行GO和KEGG富集分析(P<0.05),结果显示,GO功能分析得到 3 255 个生物过程(biological process,BP)、171个细胞组成(cellular component,CC)、323个分子功能(molecular function,MF)。其中,BP主要涉及细胞对化学压力的反应、对类固醇激素的反应、上皮细胞增殖等,CC主要包括膜微区、质膜筏等,MF主要包括核受体活性、类固醇激素受体活性等。KEGG通路分析得到135条通路,主要涉及HIF-1信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、内分泌抵抗、雌激素信号通路等,见图5。

图5 GO功能和KEGG通路富集分析图(前10位)

2.5 分子对接选择活性成分槲皮素、β-谷甾醇分别与核心靶点AKT1、MAPK1进行分子对接,结果显示结合能均小于-5 kcal·mol-1,活性成分与核心靶点通过形成氢键等分子作用力相互结合且结合活性较好,见图6。

图6 分子对接结合能热图

3 讨论

SA归属于中医学“女子不月”“血枯”等范畴[10]。《金匮要略·妇人杂病脉证并治》言：“因虚、积冷、结气,为诸经水断绝”,论述了“经水断绝”的病机,不外虚实两类;精血不足,血海空虚,因虚闭经者,补而通之;气血瘀滞,血海阻隔,因实闭经者,泻而通之;亦或虚实夹杂,补中有通,攻中有养[11]。中药川牛膝始见于《仙授理伤续断秘方》,是主产于四川天全的道地药材和大宗药材。《四川中药志》记载：“川牛膝能活血祛瘀,催产,引血下行,用于血滞经闭,痛经,难产等[12]。”《中国药典》也记载：“川牛膝善于逐瘀通经,性善下行(引血下行)。”此外,川牛膝能滋补肝肾,兼顾经血之源,是临床用于妇科瘀滞经闭最为理想的药物之一[13]。

川牛膝含有甾酮、多糖、皂苷等多种活性成分,药理活性涉及调节血液黏稠度、改善循环、抑制肿瘤细胞生长、增强免疫、抗炎镇痛、抗病毒、抗生育和着床等方面[8]。川牛膝中的多糖成分具有促进血液循环的作用,可能是其发挥“逐瘀通经”作用的药理基础,作用机制可能与多糖成分降低全血和血浆黏稠度、增强红细胞变形能力有关[14]。此外,川牛膝提取物能明显增加细胞迁移,促进血管生成,触发血管重构和分化的信号传导,这可能是其促进月经来潮的机制之一[15]。川牛膝对生殖系统的作用主要表现在对子宫的兴奋作用[16]。川牛膝提取物具有抗生育作用,主要分为抗着床和抗早孕两个环节[17]。川牛膝含有多种甾酮类天然植物雌激素,如槲皮素等异黄酮类化合物与17β-雌二醇有相似的结构,具有弱雌激素作用,其对子宫内膜的刺激作用远小于雌激素,既能发挥雌激素样作用,又能降低子宫内膜癌和乳腺癌的风险[15]。此外,异黄酮具有降血糖活性[18],在胰岛素抵抗的细胞模型中,蜕皮甾酮能增加胰岛素敏感性[15],对于PCOS所致闭经,可在一定程度上缓解内分泌抵抗。

本研究发现川牛膝主要活性成分为槲皮素、β-谷甾醇、红苋甾酮、甜菜素,其中槲皮素作用靶点达136个,表明川牛膝促进月经来潮具有多成分、多靶点的作用特点。黄酮类化合物槲皮素通过抑制血小板聚集和5-羟色胺释放从而调节血液循环,同时具有雌激素效应。β-谷甾醇是一种植物甾醇,具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗抑郁、抗衰老等多种药理活性[19]。下丘脑功能性闭经常由于精神刺激、体重骤降及过度运动等应激反应导致下丘脑促性腺激素释放激素(gonadotropin releasing hormone,GnRH)分泌抑制,形成低GnRH状态[2]。研究发现,β-谷甾醇结合在小鼠下丘脑GnRH神经元GT-17细胞膜上,通过影响雌激素受体信号通路抑制NF-κB上游因子降解,阻断NF-κB信号通路激活,从而缓解GnRH分泌减少的状况[20]。

GO功能富集分析发现川牛膝治疗SA主要涉及受体配体活性、信号转导受体激活剂、RNA聚合酶Ⅱ特异的DNA结合转录因子结合、细胞因子受体结合等生物过程。KEGG通路富集分析发现,川牛膝治疗SA的通路主要包括HIF-1信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、内分泌抵抗和雌激素信号通路等。缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)是具有螺旋-环-螺旋结构的转录因子,由氧调节亚基α和组成型表达的β亚基组成,能够诱导血管形成蛋白表达。HIF-lα是低氧反应的重要转录因子。Critchley等[21]发现女性月经周期分泌中期、晚期及月经期的子宫内膜HIF-1αmRNA表达量显著增加。周芳[22]研究发现HIF-lα在低氧状态和月经出血非缺氧状态均被激活,子宫内膜崩解的关键时期环氧合酶-2(cyclooxygenase 2,COX2)和HIF-1αmRNA表达均增加。张玲[23]研究发现雌激素通过受体抑制HIF-1α降解,激活HIF-1α信号通路,启动下游靶基因如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)合成,促进异位子宫内膜细胞的粘附、侵袭和血管生成。

SA以持续性月经停闭为特征[24],治疗重点在于顺应月经周期中阴阳转化和气血盈亏的变化规律,调控肾-天癸-冲任-胞宫轴,从而恢复正常的月经周期[25]。肾虚血瘀型SA是临床常见证型,李灵芝教授认为SA以肾虚为本、血瘀为标,治疗当以祛瘀为先,继以补肾[26]。“瘀血不祛,新血不生”,瘀血阻滞于经络,阻碍气血的运行则月经停闭。川牛膝苦泄甘缓,长于活血通经,善引血下行,常与当归、桃仁、红花等同用治疗血瘀经闭[27]。《名医别录》记载川牛膝可治疗“妇人月水不通、血结、益精、利阴气、止发白。”肾为先天之本,主藏精纳气,肝主藏血,肝肾同源;川牛膝归肝、肾两经,可以调补肝肾,调理内分泌,发挥雌激素样作用,改善子宫状态,增加子宫血流量[28],提高人体免疫力,延缓衰老,符合中医学的整体观念[29]。

本文初步探索了川牛膝治疗SA的作用机制,挖掘槲皮素、β-谷甾醇等4种活性成分,膜筏、细胞对化学应激的反应及核受体活性等过程,HIF-1信号通路、雌激素信号通路、内分泌抵抗等通路。但川牛膝的产地丰富、品种多样,他们的化学成分可能存在差异,其具体机制仍需进一步验证。此外,网络药理学方法在不断完善,各数据库之间存在数据差异,提高数据库的共享性、精度和准确度也是未来的研究方向之一。