1例ABO疑难血型的鉴定与临床疑难输血探讨

周 宇,牛长春,廖 璞,陶翠华

1.川北医学院,四川南充637002;2.重庆市人民医院检验科,重庆401121;3.武汉亚洲心脏病医院输血科,湖北武汉430022

输血是现代医疗中不可缺少的一部分,但输血之前也存在诸多的问题与挑战,其中血型鉴定对于临床输血至关重要,正确的血型鉴定才能保证临床用血的安全[1]。由于基因突变、糖基转移酶数量与活性改变等导致多种正反定型不符的亚型疑难血型出现,导致血清学鉴定难度大,交叉配血困难[2],对检验人员的能力和临床选用合适的血液制品提出了更高的要求。通过标准血清学方法进行ABO血型、不规则抗体筛查、交叉配血试验、吸收放散试验和基因测序分型等实验,可进一步提高ABO血型疑难血型鉴定的准确性,以此提高临床用血的安全性和有效性。笔者在临床住院患者日常血清抗筛检测样本中发现1例正反定型不符的情况,最终鉴定为AB亚型。虽然该例内科患者并未要求输血,但考虑亚型病例较为罕见,故通过分析该例患者的鉴定,进一步探讨了临床输血难点和策略,进而为临床疑难血型鉴定提供案例参考。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 患者,女,70岁,临床诊断为心绞痛,无输血史,有妊娠史,于2020年9月3日在武汉亚洲心脏病医院进行常规血型及不规则抗体筛查,血型检测发现正反定型不符,正定型B抗原凝集强度减弱,疑似亚型,遂进一步展开深入研究。

1.2试剂与仪器 单克隆抗-A(上海血液生物医药有限责任公司,生产批号：20200201,效价1∶256);单克隆抗-B(上海血液生物医药有限责任公司,生产批号：20200201,效价1∶128);抗-H(江苏力博医药生物技术股份有限公司,生产批号：20160707,效价1∶64);抗-A1(江苏力博医药生物技术股份有限公司,生产批号：20180830,效价1∶128);ABO红细胞(江苏力博医药生物技术股份有限公司,生产批号：202008008);3%不规则抗体筛选红细胞(江苏力博医药生物技术股份有限公司,生产批号：20200922);KA-2200日本久保田小型台式专用离心机;Ortho BioVue专用卡式离心机;Ortho vision Max奥森多全自动血型及配血分析仪。

1.3方法

1.3.1血型血清学试验 采用试管法和微柱凝胶法检测患者ABO血型、Rh血型及进行不规则抗体筛查和鉴定[3-4],此外还进行行吸收放散试验。所有试验方法均严格按照《全国临床检验操作规程》[5]或者试剂说明书进行操作。

1.3.2洗涤红细胞的制取 取4支试管,分别加入50 μL的健康人A、O、AB以及本例患者离心后红细胞,然后加入生理盐水至试管2/3～3/4处,充分振荡、混匀、洗涤后放入久保田离心机1 000 r/min离心1 min,然后弃去上清生理盐水,重复操作3～5次,最后留下的离心后红细胞即为洗涤红细胞,用于与抗-A1、抗-H反应。

1.3.3PCR法基因测序分型 全血提取DNA采用PCR法对ABO基因的7个外显子进行扩增[6-7],对7个外显子全编码区进行直接测序[8-9],并检索血型抗原基因突变数据库(BGMUT)[10]进行对比。

2 结 果

2.1本例患者ABO血型正反定型结果 试管法显示正定型有A、B抗原,反定型Bc端有弱反应,见表1。

表1 卡式法与试管法ABO血型正反定型结果

2.2健康人A、O、AB型洗涤红细胞及本例患者洗涤红细胞(Pc)分别与抗-A1、-H血清试剂的反应 O型红细胞表面存在大量前体抗原H。Pc、Ac与抗-A1反应强度相同,与抗-H反应强度则是Pc更高。见表2。

表2 健康人A、AB、O型标准红细胞及本例患者红细胞与抗-A1与抗-H抗体反应

2.3不规则抗体筛查结果 患者血清与抗筛细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号细胞反应均呈阴性,排除不规则抗体存在的可能性。见表3。

表3 本例患者血清与筛查细胞反应结果

2.4本例患者吸收放散试验结果 放散液与标准B型红细胞反应,与标准O型红细胞不反应,本例患者红细胞表面存在弱B抗原。见表4。

表4 患者红细胞吸收放散试验结果

2.5基因测序分型结果 本例患者ABO基因第1～7外显子测序显示ABO基因的第6、第7个外显子上存在297 A/G、467 C/T、526 C/G、657 C/T、703 A/G、721 C/T、796 A/C、803 C/G、930 A/G杂合,见表5;第7外显子存在碱基467C>T;721C>T变异,此突变引起多肽链氨基酸P156L;R241W替换,见表6。经检索BGMUT,此患者2个等位基因分别为A1.02和Bw.03,确认该患者ABO血型的基因型为ABO*A1.02/Bw.03。

表5 患者血型的基因测序结果

表6 单核苷酸及氨基酸替换结果

3 讨 论

ABO等位基因位于染色体9q34.1～q34.2,全长19.5 kb,编码区由7个外显子组成,长1 062 bp。第6、7号外显子约占编码区长度的77%[11],编码酶的催化活性区同时也是ABO亚型基因突变的主要区域。糖基转移酶A和B均由354个氨基酸组成,且具有高度的同源性,二者一级结构仅有4个氨基酸残基的差异。ABO血型系统具有一定的血清学特点,但分子机制各不相同,B亚型较A亚型少见,Bx则更是罕见[12],本研究患者鉴定为ABx亚型,同时血清中检出不规则的弱抗B抗体。

ABO血型基因多态性决定了ABO血型抗原多态性[13-16],但迄今为止关于ABO基因完全缺失导致O表现型的案例较少报道,也未发现ABO基因碱基连续缺失的现象,提示单核苷酸多态性(SNPs)是形成ABO基因多态性的重要因素。本例患者有2处单个核苷酸的改变导致氨基酸置换,467C>T导致156位氨基酸由脯氨酸替换为亮氨酸;721C>T使241位氨基酸由精氨酸替换为色氨酸,但第156位氨基酸不位于酶的催化活性中心,故而此处虽为氨基酸突变但并不影响糖基转移酶的活性与生物学功能。但第241位氨基酸则处于糖基转移酶的催化活性区,此处突变后蛋白质一级结构改变导致构象发生改变,使糖基转移酶的特异性、活性改变,从而造成ABO血型中B抗原表达数目减少,与抗-B反应凝集强度减弱,形成亚型。

3.1疑难输血的原则与方案策略 血型的准确鉴定是临床输血的根本,即便是亚型的疑难临床输血,也需要精确分型,亚型鉴定的意义在于为受血者选择最合适的血液保障输血安全与有效。针对上述ABx亚型的临床输血,同型供血者是最佳选择,按现有的血清学特点来看,最理想的血源应该是相同ABx亚型血液,但是在现实情况下较难以实现[17]。由于患者血清中存在弱B抗体,虽然强度不高,但在输血的时候不可忽略其作用,临床输血首先就是要保证输注的红细胞不被破坏,故而不能选用B型血和AB型血,由于患者血清中存在抗-B,所以输注AB型血同样会出现凝集反应,对于A型血,虽然血清中存在抗-B,但并不会发生强烈的凝集反应,因为B亚型抗原的表达不仅有量变而且还有质变;况且随着血液的输入,其中的抗体进入人体循环血液后,也会被稀释而效价降低,因此,A型血可作为一种输入血型,在患者有输血需求指征的时候,可以选用A型洗涤红细胞进行输注。O型红细胞被称为“万能输血型”,在紧急情况下,为挽救生命,避免同种抗体的产生,可以在交叉配血试验满足主侧不凝集的情况下,少量缓慢输入O型洗涤红细胞。总之,绝对安全的输血是没有的,亚型的疑难输血要严防血型的漏判、误判,尽可能制订准确、有效的输血策略,才能提高安全输血水平[18-19]。

3.2基因测序分型对临床罕见亚型的作用 与本例患者血清学相似的另外一种罕见亚型cisAB也是红细胞表面存在B抗原弱表达,同时血浆中有1+～3+的抗-B。2种亚型红细胞表面的A、B、AB抗原的表达强度类似,仅凭血清学格局难以肯定地区分。

检索BGMUT ABw03与cisAB基因序列,cisAB特有的碱基突变在700C>T,引起第234位氨基酸由脯氨酸替换为丝氨酸(P234S)[1];本例患者ABw03在721C>T发生了特有的点突变,引起241位氨基酸由精氨酸替换为色氨酸(R241W)。二者相比仅存在单个氨基酸的差异,但-A1和-H反应格局有明显差别。不过肉眼观察凝集强度存在主观差别,同时血清学反应也受多种其他因素的干扰,准确度不够高,还是存在无法完全肯定的情况。ABO亚型无论是抗原的量变还是质变,其血清学试验外在形式都一样,都仅表现为凝集强弱的变化,这才导致血清学鉴定困难,因此开展基因检测分型技术十分有必要[20],可作为血清学鉴定的重要补充,帮助顺利解决疑难血型鉴定困难的问题,具有重要的临床意义。

3.3ABO亚型鉴定基本方法思路 一般情况下进行ABO血型正反定型鉴定时,发现正反定型不一致,通常根据是否正定型抗原凝集强度减弱呈双群现象(混合视野MF)、红细胞表面H抗原强度以及是否可以通过吸收放散试验检测到弱抗原等进行ABO亚型的鉴定[21]。但在鉴定这种疑难血型时,既有技术问题也有患者血型的问题,故而在遇到血型鉴定正反定型不一致的情况下,除常规试验外,正定型试验增加抗-H、抗-A1、抗-AB血清抗体;反定型增加O型标准红细胞、A1型红细胞、A2型红细胞等(反定型对于亚型筛检尤为重要,正定型弱抗原不发生凝集反应的时候,反定型的弱抗体可有提示性作用,防止漏检),再进行直接抗人球蛋白试验、吸收放散试验、基因测序检测等最终准确分型[22]。

由于实验条件有限并未对本例患者进行家系调查和糖基转移酶活性的测试,缺乏ABO等位基因的遗传方式及该例ABO复合亚型出现的具体机制等信息。总之,更全面的基因序列测序和更加完整的家系调查有助于丰富ABO血型的基因多态性、ABO亚型形成的关系及其可能的遗传方式。